血管内皮通透性的细胞及信号转导调控机制*

王雪岩 刘瑞霞 郭易楠 阴赪宏,#

血管内皮通透性是指血管内外溶质和液体成分出入微血管壁的能力，包括正常生理情况下无损伤组织的微血管对水份和亲水性物质的通透，以及病理状态下微血管对大分子物质特别是血浆蛋白通透性的增加以及随之而来的大量水份的漏出，是衡量不同脏器、组织、细胞和血液进行物质交换能力的重要指标[1]。已有研究表明，引起血管内皮通透性改变的因素繁多，其中，某些刺激所致内皮细胞功能紊乱和屏障功能受损会使血管内皮通透性明显上升，导致大量蛋白和液体从循环内丢失，导致组织水肿和低蛋白血症形成，血浆胶体渗透压进一步下降使有效循环血容量难以维持，进而导致心输出量降低、组织灌注不足继续加重、氧摄取进一步下降，最终导致多器官功能障碍综合征(MODS)的发生[2-5]。因此， 对血管内皮通透性的研究具有广泛的临床意义。

血管内皮通透性受多种因素调节，细胞层面主要为血管内皮细胞、内皮细胞间的紧密连接、黏附连接、内皮-基底膜间的黏附连接，基底膜完整性以及内皮细胞骨架蛋白共同调控血管内皮通透性；信号转导中的环磷酸腺苷/蛋白激酶A(cAMP/PKA)、蛋白激酶C(PLC)、Rho GTP、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38)/MAPK、PKC等信号通路及其组成的级联反应在血管内皮通透性调控中发挥着重要作用，各因素之间既相互独立又相互渗透。本文就近年来血管内皮通透性的细胞和信号转导调控机制研究进展予以综述。

1 血管内皮通透性的细胞层面调控机制

血管内皮屏障功能的变化是血管内皮通透性改变的主要原因。血管内皮屏障是血管腔面的一层半选择性的通透屏障，由血管内皮细胞层和基膜层组成。生理情况下，细胞与细胞、细胞与胞外基底膜间的黏附状态和内皮细胞的收缩力在内皮细胞通透性的调节中相互制约，处于动态平衡，共同构成内皮屏障功能，对维持循环稳定和组织器官正常功能具有重要意义[6]。血管内皮细胞是覆盖在血管内腔表面的连续单层扁平细胞，作为血液与血管壁之间的屏障，直接与血液循环接触，具有调节细胞通透性、止血、抗凝、纤溶以及调节血管张力、影响血管发生、调节血管与组织间隙液体平衡稳态等多种作用，是机体微循环的关键组成部分。

从细胞层面来看，影响血管内皮通透性的因素主要包括：(1)内皮细胞间连接；(2)内皮-基底膜间黏附连接及基底膜的完整性；(3)内皮细胞骨架(包括微丝、微管、中间丝、肌动蛋白、肌球蛋白等)，下面将从以上三个因素分别阐述血管内皮通透性的细胞层面调控机制。

1.1 内皮细胞间的连接

1.1.1 紧密连接(Tight Junctions, TJs)对血管内皮通透性的影响：TJs存在于内皮细胞间连接的最顶端，是由多种跨膜蛋白、膜周边蛋白和连接粘附分子(Junctional Adhesion Molecule，JAM)组成的复合物，其中跨膜蛋白主要包括咬合蛋白(Occlidin)、闭合蛋白(Claudine)，膜周边蛋白以带状闭合蛋白(Zona Occludens, ZO)ZO-1、ZO-2最具特征性，环绕细胞边缘排列，形成完整的内皮细胞轮廓。TJs是调节物质通过细胞旁途径跨膜转运、维持血管内皮屏障功能的结构基础，具有“屏障”和“栅栏”的作用，病理状态下，血管内皮通透性的改变，主要通过影响TJs蛋白的表达、结构和功能从而调控旁细胞途径通透性[7]。

近年来，学者们对TJs的作用进行了广泛的研究，Wilkinson等[8]研究证实心脏内皮细胞TJs的形成依赖细胞外信号调节激酶(Extracellular Signal Regulated Protein Kinase, ERK)的激活，而他汀类药物能够激活ERK5，诱导ERK5磷酸化，并能抑制阿霉素对TJs的干扰，促进内皮细胞TJs的形成，进而缓解血管内皮通透性增高，发挥心脏保护作用。Johnson等[9]通过检测ccm3基因敲除(ccm3-/-)小鼠脑血管内皮细胞TJs处的Claudine和ZO-1的表达变化，证实缝隙连接处的连接蛋白43(Connexin 43, Cx43)异常会增加家族性脑海绵状血管畸形(Familial Cerebral Cavernous Malformations type III, fCCM3)的发生，并通过干扰TJs复合物的形成，致脑微血管内皮细胞旁通透性增加。上述研究表明，在不同的生理和病理条件下，多种细胞间结构和信号转导通路可以通过作用于TJs蛋白，能够引起TJs蛋白表达和分布的不同改变，并调节旁细胞途径通透性，提示以TJs为结构基础的旁细胞途径通透性改变提供了可能的治疗思路和靶点。

1.1.2 黏附连接(Adherens Junctions, AJs)对血管内皮通透性的影响：AJs是指两个邻近内皮细胞之间20-35nm的间隔，AJs的功能是通过钙粘蛋白(Cadherin)直接连接到p120、连环蛋白(Catenin)和斑珠蛋白(Plakoglobin)实现的。AJs主要作用是保持细胞形状，维持组织整体性。AJs主要由血管钙粘蛋白(VE-cadherin，VE-cad)充填，VE-cad胞内段特定结构域与Catenin、肌动蛋白(F-actin)细胞骨架相连，形成VE-cad/catenin/F-actin复合物，内皮细胞膜表面VE-cad的分布规律、VE-cad细胞内多肽是否磷酸化、VE-cadherin/catenin/F-actin复合物是否解离，是调控AJs的关键节点[10]。VE-cad在调控内皮细胞通透性，维持内皮细胞的完整、白细胞的迁移以及血管生成等方面起着重要作用。已有研究证实在小鼠体内注入阻断VE-cad的单克隆抗体，可以引起以血管内皮细胞损伤为特征的血管通透性增高，且损伤程度与注入量呈正相关[11]。Ikezoe等[12]通过VE-cad易位检测等实验证实，血栓调节蛋白通过抑制Src/VE-cad信号通路，减轻钙调磷酸酶抑制剂诱导的血管通透性增高。新近研究提示通过建立血管内皮细胞肺炎衣原体感染模型，透射电镜观察外周血单核细胞迁移程度等发现肺炎衣原体感染通过VE-cad的酪氨酸磷酸化增加内皮细胞通透性，进而促进单核细胞迁移，加重疾病严重程度[13]。上述研究表明，AJs的各成分在信号通路中调控血管内皮通透性的功能逐步被发现并证实，有希望研发新的治疗药物和方案。

1.2 内皮-基底膜间AJs及基底膜完整性

基底膜是由胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白等构成的细胞外基质膜，位于内皮细胞的基底面，内皮细胞与基底膜间的黏附主要由整合蛋白及其相关蛋白构成。整合蛋白是跨膜糖蛋白，介导细胞-基质、细胞-细胞之间的相互反应，整合蛋白作为内皮细胞表面受体，由α和β亚基构成异二聚体，通过与基底膜蛋白结合引起细胞骨架重构和细胞形态改变，从而影响内皮细胞的屏障功能[14]。2017年McCurley等[15]通过建立大鼠肾缺血再灌注损伤实验动物模型，给予avb5抗体后进行组织病理学评估，研究结果提示抑制整合蛋白 avb5能够缓解血管内皮通透性增高，保护对抗肾缺血后再灌注损伤。2018年国内最新研究证实抑制整合蛋白 α 5 β 1亚基能缓解血管内皮生长因子(VEGF)诱导的视网膜新血管生成和因抑制NLRP3炎性体信号通路所致的微血管渗漏[16]。上述研究提示整合蛋白功能的激活及其引起的相关血管活性物质、信号通路等改变，能诱导微血管结构功能的改变，导致内皮屏障功能受损，也从另一侧面提示，整合蛋白亚基组成不同或其配体改变可能产生迥然不同的生理效应。

1.3 内皮细胞骨架蛋白

细胞骨架包括微丝、微管和中间丝，其中微丝是由肌动蛋白(Actin)、肌球蛋白(Myosin)、原肌球蛋白构成。正常内皮细胞骨架肌动蛋白F-actin沿细胞周边排列，光滑致密，形成完整肌动蛋白环；F-actin骨架包括不同的微丝束类型，如应力纤维、细胞周边的致密外周束、中央短纤维等，它们之间可以相互转化。细胞骨架正常分布使不同的细胞维持特有的形态和弹性，占一定的空间方位，并影响细胞黏附、识别等。细胞骨架结构的动态变化则是调控细胞运动、形态和跨膜信息转导的结构基础[17]。很多信号通路参与细胞骨架重构的调控，其中Rho/Rho激酶信号通路是控制细胞骨架重构的分子开关。Choi等[18]观察人脐静脉纳皮细胞(HUVEC)分别在给予凝血酶干预和达比加群酯+凝血酶干预后细胞骨架actin的形态学改变，结果提示凝血酶通过与蛋白激酶1结合诱导细胞骨架actin重组，而达比加群酯能够逆转因凝血酶所致的细胞骨架Actin的形态改变和内皮细胞间隙增大，降低血管内皮通透性，保护血管内皮屏障完整性。此外，Li等[19]研究爱帕琳肽-13(Apelin-13)在糖尿病黄斑水肿时对视网膜微血管通透性的影响，结果提示Apelin-13通过PI3K/Akt和MAPK/Erk信号通路上调细胞骨架蛋白和紧密连接蛋白的表达，促进视网膜新生血管形成，抑制Apelin-13表达能够稳定内皮细胞骨架，显著减少视网膜血管增生，减轻糖尿病黄斑水肿。因此，如能找到具有稳定内皮细胞骨架而又无明显全身毒副作用的药物，则可防治内皮细胞回缩和细胞间裂隙形成，抑制内皮通透性增加，为相关药物副作用及抗内皮通透性水肿的临床治疗提供新的手段。

2 调节血管内皮通透性的相关信号通路

参与血管内皮通透性调节的信号通路非常复杂，不同的信号通路间也会相互影响。近年来研究发现cAMP/PKA、磷脂酶C(Phosphoilpase C,PLC)、Rho GTP、p38/MAPK、PKC等信号通路组成的级联反应在微血管通透性的调节中扮演着关键角色。

2.1 cAMP/PKA信号通路

cAMP/PKA信号通路是一条经典的G蛋白偶联细胞信号传导途径，外界信号分子刺激膜体后，激活细胞内的腺苷酸环化酶，导致细胞内cAMP水平升高，从而激活PKA，产生一系列的生物学反应，参与多项细胞生理活动。cAMP反应元件结合蛋白(CREB)广泛存在于真核细胞核内，是一种磷酸化起作用的转录因子，位于PKA通路下游，许多与PKA信号通路相关的重要生物学事件均由CREB磷酸化介导，目前已知cAMP能参与细胞间连接的调控，进而影响内皮细胞屏障功能，Perrct 等[20]研究证实，持续激活cAMP/PKA信号通路，会引起血管内皮屏障功能紊乱，其机制是通过CREB3调节RAS相关蛋白的转录与表达，而RAS相关蛋白通过结合VE-cad进而破坏细胞间连接致血管内皮通透性增加。相反地，另有研究提示cAMP /PKA信号通路激活起到保护内皮细胞屏障功能的作用，研究结果发现：经百草枯处理的HUVECs内 cAMP含量降低，大分子白蛋白通透性增加，而百草枯处理后再加入红霉素，HUVECs内cAMP含量增加，对大分子白蛋白通透性降低，并且cAMP含量增加与通透性增大均有时间依赖性，同时相关性分析也显示cAMP含量随通透性增大、时间延长而降低，内皮细胞通透率与cAMP浓度呈明显负相关，证实红霉素能改善百草枯中毒所致的血管内皮细胞屏障功能受损，其机制是通过升高内皮细胞cAMP浓度、降低细胞通透性实现[21]。总之，cAMP/PKA信号通路常作为多种药物的作用靶点，对血管内皮通透性的研究与治疗具有重要意义。

2.2 PLC通路

PLC是磷脂酰肌醇信号通路的关键酶，在机体内分布广泛，许多细胞外信号分子，如激素、神经递质、免疫球蛋白、细胞因子、生长因子等都可以激活PLC。活化的PLC能水解磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(PIP2)，从而产生两种重要的第二信使：二酯酰甘油(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)，进而将细胞外信息传递给下游效应分子，综合近年文献发现，许多血管活性因子均可通过活化PLC，作用于血管内皮细胞，调节血管内皮通透性，而此过程是多种疾病在血管中的重要病理基础。Bijli等[22]通过给予PLC-基因敲除(PLC-/-)小鼠雾化吸入脂多糖(LPS)，构建急性肺损伤(Acute Lung Injury, ALI)动物模型，发现：PLC-在控制肺血管炎症和白细胞渗漏中扮演重要角色；此外，PLC-能通过降解AJs中的VE-cadherin和促actin应力纤维变形，缓解内皮屏障功能紊乱；以上研究揭示了PLC信号通路在ALI时肺微血管内皮细胞炎症及内皮功能紊乱中的作用。另有研究提示，RhoC通过MAPK抑制内皮细胞的迁移能力，其下游MLC-2信号通路通过抑制PLC-γ/Ca2+/eNOS通路级联反应降低血管通透性[23]。总之，PLC信号通路常作为多种药物的作用靶点，对血管内皮通透性的研究与治疗具有重要意义。

2.3 Rho GTPases通路

Rho GTPase在细胞信号转导过程中作为信号转换器，通过调控细胞骨架，在血管内皮通透性增高的疾病中发挥重要作用。Rho蛋白与GTP结合时呈现激活状态，激活后作用于下游靶分子，如Rho激酶(Rho Associated Kinase, ROCK)，使其磷酸化而激活，后者活化后进一步作用于下游一系列靶分子,最终引起细胞骨架结构改变，微丝聚合，从而使细胞收缩，细胞间紧密连接结构受到破坏[24]。近年有学者以TNF-α干预人脐静脉内皮细胞株(EA.hy926)，建立炎症刺激细胞模型，用乌司他丁干预EA.hy926细胞，构建Rho过表达慢病毒，采用Transwell法、TEER法检测细胞通透性，免疫荧光法检测肌球蛋白磷酸酶结合亚基-1(p-MYPT1)的表达及细胞F-actin形态及分布，分别采用免疫细胞化学法、Western blot法及RT-PCR法检测与通透性相关的关键分子RhoA和VE-Cad表达的变化情况，证实乌司他丁通过抑制Rho/ROCK信号通路的激活，缓解TNF-α引起的血管内皮通透性增加，改善炎症状态下血管内环境的紊乱[25]。上述提示抑制Rho/Rho激酶信号通路有着显著的血管内皮保护作用，为治疗血管屏障功能损伤提供了靶点，并为有效的药物治疗提供理论依据。然而，该通路的调节机制以及与其它通路的交叉反应尚需进一步研究。

2.4 p38 MAPK通路

p38/MAPK是细胞内广泛存在的丝/苏氨酸蛋白激酶超家族，在炎症、氧化应激、细胞生长与凋亡、细胞周期及缺血/再灌注损伤等重要的生理、病理过程中具有重要作用。相关致病因素作用于血管内皮细胞，诱导p38/MAPK激活，促进钙内流，引起细胞内钙超负荷，造成血管内皮通透性增大，同时p38/MAPK的激活也可通过调节下游蛋白活性，诱导F-actin的再生和重组，使细胞间连接关系改变，进而影响血管内皮通透性[26]。目前，学者们发现许多药物通过抑制p38/MAPK信号通路的激活，改善血管内皮通透性增加进而发挥器官保护作用，例如糖皮质激素与透明质酸结合治疗，能通过抑制p38/MAPK磷酸化，降低肺微血管通透性，缓解LPS所致的大鼠肺损伤[27]；选择性p38/MAPK抑制剂能抑制血管通透性增高，进而延缓糖尿病血管并发症的发生和发展。Thakre-Nighot等[28]研究提示，消炎痛能引起TJs闭合蛋白重新分布，破坏胃粘膜屏障，而抑制p38/MAPK通路则可以保护TJs闭合蛋白，改善胃粘膜通透性，明确p38/MAPK可以作为靶点消除消炎痛的副反应。因此，研究P38/MAPK信号通路对血管通透性增高类疾病的治疗具有重要临床意义，然而，如何与其它信号通路进行可能的联系，扩大血管内皮损伤的防御体系尚有待进一步探讨。

2.5 PKC通路

PKC是一系列细胞级联信号转导途径的关键环节，可对各种刺激因子如生长因子、神经递质、激素等发挥重要的信号调节作用[29]。其中，血管内皮屏障功能与PKC活性密切相关，既往研究提示，ROS可以通过激活PKC而使TJs 闭合蛋白和ZO1磷酸化，引起闭合蛋白重分布，闭合蛋白与ZO-1分离，破坏细胞间TJs，致血管内皮通透性增加，参与血管性疾病的发生与发展的病理过程，提示PKC的激活在血管内皮屏障功能和血管通透性的变化调节中起着重要作用。新近研究表明，原发性乳腺癌肺转移时，VEGF-PKC通路活化可导致内皮细胞TJs破坏，促使肺血管通透性增高，引起癌细胞肺部转移[30]。Ku等[31]证实罗格列酮能激活PI3K、Akt、PKC ，增加VEGF表达，抑制内皮紧密连接蛋白的表达，促新生血管形成和视网膜和主动脉处的微血管渗漏，提示PI3K、Akt、PKC抑制剂能缓解罗格列酮诱导的内皮细胞迁移所致的血管内皮通透性增高，这意味着通过抑制PKC活化减轻血管内皮功能紊乱不能完全达到防止罗格列酮的副反应的目的。总之，PKC信号通路常作为多种药物的作用靶点，对血管内皮通透性的研究与治疗具有重要意义。

3 总结与展望

血管内皮通透性增加是临床多种疾病的始动因素和中心环节，目前血管内皮结构、屏障功能改变及相关信号通路转导等在相关疾病发生发展中的机制日趋明确，是由相互联系、形成网络的多种信号途径实现的，既相互独立又相互渗透，这便是所谓的信号“cross talk”，这对各条信号途径之间平衡调控血管内皮屏障的正常活动具有十分重要的意义。当前针对血管内皮通透性增高的“靶向”治疗仍非常有限，在临床实践中寻找有效治疗靶点给予最个体化治疗，更深入的基础和临床实验值得探索与期待。