miR-141及MMP-16对骨性关节炎疼痛及软骨损伤的影响

胡 玲，马 垚，胡 冰，余文雄，左 毅

(武汉科技大学附属天佑医院，湖北 武汉 430064)

骨性关节炎(OA)是一种以关节软骨变性、破坏及骨质增生为特征的慢性疼痛性疾病。我国OA患病率约为15%，同时伴随年龄的增长，其患病率不断升高，最终导致残疾[1-2]。近年来的研究表明，微小RNA(miRNA)具有调节软骨发育及维持软骨代谢平衡的作用，通过对其下游多靶点基因的干预，可调节软骨细胞分化、生长和修复，从而影响OA的病变过程[3]。miR-141是OA患者血液中具有高度特异性的miRNAs，其降低与关节软骨细胞凋亡和炎症相关，可影响OA的进展；同时其可通过对炎性因子及神经细胞中致痛因子的调控，从而对OA产生的疼痛具有调节作用[4]。miR-141家族在OA患者软骨组织中的表达明显高于正常组织[5],生物信息学分析发现其能被特定的基质金属蛋白酶-16(MMP-16)所调控而影响骨关节炎的进展。因此如何在早期阻断关节软骨的损伤，减轻或消除疼痛，改善关节功能，降低致残率是OA研究领域中的重要课题。本实验拟通过观察OA模型大鼠背角神经元中miR-141及软骨组织中MMP-16的表达情况来探究它们的相关性及功能意义，以期为OA严重程度的判断及靶向治疗提供新思路和理论依据。

1 实验资料

1.1 动物 健康雄性SD大鼠30只，体质量250～300 g，武汉大学实验动物中心提供。分笼进行饲养，自由饮食。环境温度20～26 ℃，湿度50%～70%，昼夜节律以1∶1进行调节。

1.2 主要试剂和仪器 兔抗大鼠MMP-16抗体(博士德BA1280)，兔二步法检测试剂盒(中杉金桥PV-6001)；miScript Ⅱ反转录试剂盒(QIAGEN-218161)、miScript SYBR Green PCR 检测试剂盒(QIAGEN-218073)、1% 琼脂糖、漩涡振荡机(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司)；Heraguard EC 超净工作台( 美国 Thermo Scientific公司) ；单道可调移液器(德国 Eppendorf 公司)；CFX96 荧光定量PCR仪(美国 Bio-Rad 公司)；Power Pac Basic 电泳仪(美国 Bio-Rad 公司)；水平电泳槽(美国 Bio-Rad 公司)。

1.3 分组及造模 将SD大鼠编号后，随机分为实验组20只和对照组10只。采用苯巴比妥麻醉大鼠，仰卧位固定，以左侧膝关节作为手术侧，常规备皮消毒。髌旁内侧切口显露膝关节，暴露髌骨后向外侧脱位，尽量屈曲膝关节显露前交叉韧带，实验组直视下切断前交叉韧带，抽屉试验确认完全切断后彻底止血，将髌骨复位，1号丝线逐层闭合关节腔。对照组不切断前交叉韧带，其余处理同实验组。术后大鼠手术侧给予固定，分笼饲养，每只大鼠肌注青霉素20万IU/d预防感染，连续术后3 d。

1.4 冷痛阈测定 分别在手术前连续3 d以及手术2，8周后，于每天上午的固定时间点进行测量。测量前将大鼠静置入多孔钢丝笼中，适应环境15 min后，在右侧皮区(右侧为优势区，更加敏感)悬滴0.5 mL冷丙酮，记录滴下冷丙酮后1 min内后爪抓挠皮区或理毛的次数，重复测量3次，每次间隔5 min，取3次记录值的平均值作为冷痛阈值。

1.5 软骨组织病理切片观察 2组分别于手术2，8周后各断颈处死一半大鼠，取2 cm×0.5 cm软骨组织，经生理盐水冲洗后，即行多聚甲醛固定、脱钙、冲洗、脱水、透明、石蜡包埋、切片，通过苏木精-伊红染色观察大鼠骨关节的形态变化。

1.6 背根神经节组织中miR-141表达检测 采用RT-PCR法检测。断颈处死大鼠后取L4—6脊髓组织，分离出双侧脊髓背角组织，提取总RNA，在荧光定量PCR仪上按照标准步骤进行反应。按照反应体系配置说明配备总反应液25 μL：其中2×Quantiect SYBR Green PCR 12.5 μL，10×miscript Universal Primer 2.5 μL，10×miscript Primer Assay 141 2.5 μL，RNase-free water 5 μL，Template CDNA 2.5 μL，每个样本设3个复孔，反应条件为：95 ℃预变5 min，1个循环。15 s 94 ℃，30 s 55 ℃，30 s 70 ℃，40个循环。计算2-ΔΔCT值进行定量分析，2-ΔΔCT值表示目的基因相对表达量。

1.7 MMP-16蛋白表达检测 采用免疫组化法检测。取4 μm厚的软骨组织切片，常规脱蜡至水，0.3% H2O2孵育10 min阻断内源性过氧化物酶。0.01 mol/L PBS冲洗5 min×3次，将切片浸入0.01 mol/L柠檬酸盐抗原修复液(pH=6.0)，高压2 min抗原修复，冷却至室温。0.01 mol/L PBS冲洗5 min×3次，滴加一抗(MMP-16浓度为1∶200)，4 ℃冰箱孵育过夜。0.01 mol/L PBS冲洗5 min×3次，滴加生物素标记的二抗，室温孵育30 min。0.01 mol/L PBS冲洗5 min×3次，DAB显色，苏木素复染，树胶封片。PBS代替一抗作为阴性对照。镜下阳性细胞核呈深浅不一的棕色，随机10个视野下计数阳性着色细胞。

2 结 果

2.1 手术前后大鼠冷痛阈值比较 手术2，8周后，对照组大鼠对冷丙酮刺激的阳性反应次数未见明显变化(P均>0.05)；实验组大鼠对丙酮刺激的阳性反应次数明显高于对照组(P<0.05)，并且随着时间的延长，阳性反应次数明显增加(P<0.05)。见表1。

表1 2组大鼠手术前后冷痛阈值比较次)

注：①与手术前1 d比较，P<0.05；②与手术后第2周比较，P<0.05；③与对照组比较，P<0.05。

2.2 大鼠滑膜软骨组织HE染色表现 对照组大鼠假手术2周和8周后HE染色表现无明显变化，软骨细胞形态扁平，排列整齐，结构清晰，无炎性细胞浸润，无充血增生，间质内无纤维化。实验组大鼠手术2周后软骨细胞发生收缩，数量增多、排列紊乱，基质染色减退，此时发生以巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞为主的急性炎性细胞浸润，可见明显的增生血管和轻度纤维化；手术8周后，大鼠软骨细胞数量明显减少，形态消失，可见成团积聚的炎症细胞出现，同时组织裂隙较深，基质不可染色，出现关节结构的改变。见图1～3。

图1 假手术2周后对照组大鼠滑膜软骨组织HE染色表现 (×100)

2.3 大鼠背根神经节组织中miR-141相对表达量 手术2，8周后，实验组大鼠背根神经节组织中miR-141相对表达量均明显高于对照组(P均<0.05)，且手术8周后明显高于手术2周后(P<0.05)。见表2。

图2 手术2周后实验组大鼠滑膜软骨组织HE染色表现(×100)

图3 手术8周后实验组大鼠滑膜软骨组织HE染色表现(×100)

组别n手术2周后手术8周后对照组513.43±2.3414.54±3.82实验组1028.54±62.72①34.56±7.98①②

注：①与对照组比较，P<0.05；②与手术2周后比较，P<0.05。

2.4 大鼠软骨组织中MMP-16蛋白表达情况 对照组大鼠假手术2，8周后骨组织中MMP-16蛋白表达量比较差异无统计学意义(P均>0.05)；实验组大鼠手术2，8周后骨组织中MMP-16蛋白表达量均明显高于对照组(P均<0.05)，且手术8周后明显高于手术2周后(P<0.05)。见图4～6。

图4 假手术2周后对照组大鼠软骨组织中MMP-16蛋白表达情况(×100)

3 讨 论

OA作为一种累及关节软骨的慢性退行性病变，其病因尚不清楚，患者主要表现为关节疼痛及肿胀，这与软骨及其微环境的合成代谢障碍所致的胞外基质(ECM)退化和关节软骨的损伤有关，随着软骨的破坏、外界机械因素刺激以及游离物质的析出，导致疼痛加剧及关节活动受限，最终出现关节畸形[6-7]。miRNAs是一类长度为22个小核苷酸，来源于内源染色体上的非编码单链RNA，它们在进化上具有高度的保守性，能够通过与靶mRNA特异性的碱基互补配对，引起靶mRNA 降解或抑制其翻译，从而调控基因进行转录后的表达。参与细胞增殖凋亡、器官形成、炎症免疫应答、炎性疼痛、肿瘤发生等进程[8]，近年来研究表明miRNAs的表达差异与OA发生、发展过程中关节软骨破坏、软骨细胞凋亡、滑膜炎症以及疼痛等病理变化关系密切[9]。miR-141是一种在软骨组织中表达的miRNAs。张文明[5]发现在成骨过程中，miR-141是成骨负性调节因子，它通过转录后抑制降低Dlx5/Msx2/Runx2信号轴的级联作用，减少成骨表达和成骨作用。申发娟等[10]研究发现miR-141高表达的胃腺癌SGC-901细胞E-cadherin表达增加，N-cadherin、MMP-9表达减少，细胞迁移减少。这些都提示miR-141与骨细胞代谢生长、肿瘤、炎症有密切关系。本实验发现，实验组手术2，8周后背根神经节组织中miR-141表达量均明显高于对照组，且手术8周后高于手术2周后，表明随着OA的发展，miR-141呈现持续上升的趋势。另外手术2周和8周后实验组大鼠对丙酮刺激的阳性反应次数明显高于对照组，且随着病情进展其阳性反应次数明显增加。推测脊髓背根神经元中miR-141升高可以导致OA疼痛的发生，并可反映严重程度。

图5 手术2周后实验组大鼠软骨组织中MMP-16蛋白表达情况(×100)

图6 手术8周后实验组大鼠软骨组织中MMP-16蛋白表达情况(×100)

随着分子生物学的快速发展，MMP-16在OA发病中的作用备受关注。Nobuaki等[11]发现IL-1β通过Wnt16信号通路诱导MMP-16产生并促进成骨细胞的增殖，但在OA患者中发现MMP-16不仅可以降解ECM，而且也可以激活MMP-2在酶原水平上调节细胞外基质降解，这都促进了OA的发展[12]。Zhang等[13]证实下调miR-155可以导致MMP-16的基因表达增加，降解ECM，从而引起椎间盘疾患，而上调MMP-16的表达可达到治疗腰椎间盘突出的作用。本实验发现，实验组大鼠手术2，8周后骨组织中MMP-16蛋白表达量均明显高于对照组，且手术8周后明显高于手术2周。这表明MMP-16在OA的病理过程中起到降解软骨细胞，促进病情发展的作用。

综上所述，在OA的发展过程中，脊髓背角细胞中的miR-141可导致关节疼痛，而MMP-16可以竞争性地降解软骨细胞ECM，促进OA的发展。两者相互作用促进病情的发展，最终可能导致OA晚期出现关节疼痛和畸形，但两者之间如何互相调节还有待于进一步研究。

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