HPLC法测定不同林下黄连中5种生物碱含量

杨 繁，杨 旭

(湖北生态工程职业技术学院，湖北 武汉 430200)

黄连(CoptischinensisFranch.)为毛茛科黄连属(CoptisSalisb.)多年生草本植物，始载于《神农本草经》；分布于四川、贵州、湖南、湖北、陕西南部等地[1]。湖北地区一般生长在海拔1 000～1 800 m的山区，喜阴湿凉爽气候，属喜阴植物，忌强烈的直射光照射，喜弱光、怕强光。传统的黄连种植方式以简易棚栽为主，该方式除了占用大量的土地资源，还需人工搭棚遮阴，消耗大量的林木资源和劳动力。根据调查显示，每种植1 hm2黄连需要破坏3 hm2林地，消耗150 m3木材[2]。随着人口的不断增加，土地越来越紧张，人们保护森林资源、保护生态环境的意识也在逐步增强，对土地的开发利用已走上了综合立体的模式。为充分利用林地资源，发展林下经济已成为林区群众致富的一个重要途径[3]。

根据黄连怕光喜阴的生物学特性，在恩施州新塘乡太山庙黄连生产基地(30°09′45″N， 109°48′63″E)，海拔约1 780 m，选取与黄连适生海拔、土壤等立地条件相近的厚朴林(MagnoliaofficinalisRehd. et Wils.)、黄柏林[Platycladusorientalis(Linn.) Franco.]、杉木林[Cunninghamialanceolata(Lamb.)]、休耕地(CK)[4-5]作为试验地。通过现有林地林冠结构对光、热、水等的再分配，使林下的生态环境适于喜湿、耐荫黄连的生长发育，以期为林下黄连的栽培种植提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

2011年10月在各试验地栽植2年生黄连苗，补苗、病害防治、除草、施肥等均按传统种植方式统一进行。2016年10月采集栽培种植黄连植株的根、茎、叶、须根，分别测定各器官的盐酸小檗碱、盐酸药根碱、表小檗碱、盐酸黄连碱和巴马汀含量。

1.2 方法

采用HPLC法。色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-0.03 mol·L-1磷酸二氢钾溶液(V∶V为65∶35，每100 mL甲醇-0.03 mol·L-1磷酸二氢钾溶液中加十二烷基硫酸钠0.6 g，再用甲酸调节pH值至3.5)为流动相，流速为1.0 mL·min-1，检测波长350 nm，柱温35 ℃。

混合对照品溶液的制备。精密称量对照品适量，加甲醇，制成每1 mL对照溶液含盐酸小檗碱、表小檗碱、盐酸黄连碱、巴马汀和盐酸药根碱分别为90.51、13.20、29.30、24.70、12.01 μg的混合溶液。

供试品溶液的制备：取黄连样品粉末(过2号筛)约0.2 g，精密称量，置具塞锥形瓶中，加入甲醇-盐酸(V∶V为100∶1)的混合溶液50 mL，密塞，称量；超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，冷却，再称量，用甲醇补足减少的质量，摇匀，过滤；精密量取续滤液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.3 标准曲线的制备

精密吸取混合对照品溶液1、2、3、4、5 μL，进行高效液相色谱测定。以进样量(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，分别得出5种生物碱的标准曲线。对照品盐酸药根碱，y=518.94x-21.463，r=0.999 1；对照品表小檗碱，y=315.74x+12.389，r=0.998 2；对照品盐酸黄连碱，y=1265.9x-124.39，r=0.998 7；对照品巴马汀，y=1 038.7x-103.9，r=0.999 9；对照品盐酸小檗碱，y=1 349.7x-150.25，r=0.999 8。

1.4 样品测定

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，利用高效液相色谱仪测定。以混合对照品的峰面积为对照，用外标法分别计算待测样品中盐酸小檗碱、盐酸药根碱、表小檗碱、盐酸黄连碱和巴马汀的含量。

1.5 数据处理

试验数据的统计整理使用Excel软件，数据的计算与分析主要使用IBM SPSS软件。

2 结果与分析

2.1 不同林分下黄连的生物碱含量

由表1可知，不同林分下黄连植株中5种生物碱含量差异较大，盐酸小檗碱含量为20.03%～3.45%，盐酸黄连碱2.61%～0.11%，表小檗碱2.41%～0.03%，巴马汀1.64%～0.07%，盐酸药根碱0.49%～0.09%；杉木林下种植的黄连植株盐酸药根碱和表小檗碱的含量最高；黄柏林下种植的黄连植株盐酸黄连碱平均含量最高。与2015版药典规范对比可知，不同林分下种植的黄连植株的传统入药部位根部的5种黄连生物碱含量均符合《中华人民共和国药典(2015)》要求[6]，表明林下种植黄连与休耕地栽培黄连药效成分一致，是值得推广应用的栽培模式。

2.2 不同部位黄连的生物碱总含量

由于单一指标最高值出现在不同的林下种植模式中，为了全面客观地分析数据，从生物碱总量的角度，对黄连不同部位的生物碱总含量进行分析。由表2可知，生物碱总量的整体规律为根>茎>须根>叶，与曾烨等[7]的研究结果相一致；根部的生物碱总含量均值达24.90%，茎部的生物碱总含量均值次之，达到7.19%，须根部的生物碱总含量均值为6.54%，叶片的生物碱总含量均值最低，为5.25%。分别对根、茎、须根、叶4个部位的黄连生物碱含量进行不同林分之间的单因素方差分析得知，4个不同部位的黄连生物碱含量在不同林分下均存在显著差异。

表1 黄连各器官5种生物碱的含量

注：中华人民共和国药典(2015)要求黄连中生物碱含量表小檗碱≥0.8%，盐酸黄连碱≥1.6%，巴马汀≥1.5%，盐酸小檗碱≥5.5%。

表2 不同部位的黄连生物碱总含量

注：同列数据后无相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

黄柏林地与休耕地黄连的根部生物碱含量无显著差异，其他样地两两之间的黄连根部生物碱含量均存在显著差异；黄柏林地和杉树林地的茎部黄连生物碱含量无显著性差异；杉木林地与修耕地黄连的须根生物碱总含量无显著性差异。考虑到黄连的主要入药部位为根、茎部位，综合分析得出，厚朴、黄柏、杉木3种不同林分中，黄柏林下种植黄连的栽培模式较好，其黄连品质明显优于厚朴林地和杉木林地种植的黄连。

3 讨论

从单一成分来看，黄柏林下的黄连所含盐酸药根碱、表小檗碱、盐酸黄连碱分别比休耕地黄连高，杉木林下的黄连所含盐酸药根碱、表小檗碱、盐酸黄连碱分别比休耕地黄连高，表明黄柏、杉木

林下种植黄连可提高黄连品质。厚朴林下种植的黄连品质相对于休耕地略低，原因可能与高海拔的气候条件相关，在高海拔地区，落叶树种的萌芽时间较晚，达不到黄连幼苗发育期的遮阴要求。

从生物碱总含量来看，黄柏林下栽培黄连的5种生物碱总含量比休耕地黄连高。黄连传统入药部位根茎部的生物碱总含量占整株生物碱总量比重最大，与次级代谢产物在植物体内的选择性代谢累积有一定关系。同时，须根和叶的生物碱总含量占整株生物碱总量的比值高，建议可发掘黄连非传统入药部位的利用价值，以提高黄连的整株利用率[8]。

总体来看，林药复合生态系统产出黄连的有效成分含量与传统搭棚栽培黄连的有效成分含量相近，表明林药复合经营在节省人工劳动成本的同时，对于黄连品质的提升和田间管理都有着积极作用。发展黄连的林下种植不仅可以提高森林覆盖率，充分利用林地资源，提高林地使用价值，还可节省因搭棚遮阴耗费的劳动力和原材料。黄柏林下栽培黄连模式可在我国适宜的黄连产地进行推广。

[1] 中国科学院植物志委员会. 中国植物志[M]. 北京: 科学出版社, 2002.

[2] 陈桂芳, 冉成. 黄连种植对生态环境影响的初步研究[J]. 云南地理环境研究, 2003, 15(4): 61-65.

[3] 李乾友, 朱富华, 蔡梦阳. 杉木林下黄连种植技术[J]. 湖北林业科技, 2010 (2): 70-72.

[4] 李春民, 章承林, 周忠诚, 等. 鄂西南山区不同幼林林下黄连种植模式优化研究[J]. 经济林研究, 2013, 31(1): 119-123.

[5] 李春民, 徐自锦, 章承林, 等. 林下黄连种植模式研究[J]. 湖北农业科学, 2014 (12): 2817-2820.

[6] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(2015) [M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2015.

[7] 曾烨, 王学奎, 薛翔楠, 等. 湖北利川黄连不同生长龄期主要生物碱的分布及变化[J]. 中国实验方剂学杂志, 2013, 19(11): 123-126.

[8] 田浩, 石瑶, 吴丽华, 等. 不同产地不同部位云黄连生物碱成分累积研究[J]. 云南大学学报(自然科学版), 2012, 34(5): 570-576.