维生素D对大鼠脑外伤海马组织自噬及细胞凋亡的影响①

姚佳，朱莉，郭鑫，徐鹏飞，江沛，崔昌萌

1.济宁市第一人民医院，山东济宁市272000；2.华北理工大学，河北唐山市063000；3.济宁医学院附属医院，山东济宁市272000

脑外伤(traumatic brain injury,TBI)是神经外科高发疾病之一，容易发生在中青年人群中，也是致残率、死亡率较高的疾病[1]。TBI引起的不良后果，如脑组织损伤和神经功能障碍等，是由于原发性损伤和继发性损伤共同所致[2-3]，所以了解TBI的进展过程，预防或减轻继发性脑损伤，是减少患者死亡率和改善生活质量的有力保证。目前针对脑损伤所致神经元死亡的研究大多集中在细胞凋亡方面，其凋亡通路及发生过程已较为明确[4-5]。

近年来，自噬引起国内外学者的广泛重视[6-7]。有研究表明，微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)参与自噬延长阶段[8]，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ被通常用作检测哺乳动物自噬活性的重要指标[9]。最近自噬流已在许多动物模型上通过对自噬底物p62水平的检测加以说明[10]，p62可伴随自噬流一起被水解，出现水平降低；当自噬流障碍时水平升高。自噬在许多生理及病理情况下均可以被激活，如低氧、营养缺乏、线粒体功能异常、氧化应激、内质网应激及使用某些药物治疗等[11]。

近年来，动物实验和临床试验表明，活性形式的维生素D3(vitamin D hormone,VDH)治疗能够改善TBI导致的认知功能缺损和精神障碍[12-13]。本实验通过建立大鼠TBI模型，研究低浓度VDH对大鼠海马组织内LC3、p62蛋白表达和凋亡的影响，为临床脑损伤的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性Sprague-Dawley大鼠45只，清洁级，体质量(260±20)g，由华北理工大学动物实验中心提供。购入后在动物房适应性喂养1周，在室温(23±2)℃、相对湿度50%～65%标准环境下喂养。大鼠分为对照组(n=15)、模型组(n=15)和VDH组(n=15)。

1.2 试剂

VDH：美国SIGMA公司。DAB显色试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司。水合氯醛：北京中杉生物工程有限公司。TUNEL检测试剂盒：美国ROCHE公司。兔抗β-actin多克隆抗体、兔抗LC3多克隆抗体、兔抗p62多克隆抗体：美国SANTA CRUZ公司。

1.3 造模

TBI模型制作方法参考相关文献[11]报道有所改良。所有大鼠术前禁食12 h，禁水4 h。腹腔注射10%水合氯醛3～4 ml/kg麻醉大鼠，用大鼠脑立体定向仪将其头部固定。将大鼠头顶部手术区3×2 cm备皮，反复消毒3次后，于右侧顶部，做正中矢状位切口，并以矢状缝左旁2 mm、前囟后2 mm为圆心，用颅骨钻磨出一个直径6 mm的骨孔。用镊子小心去除骨瓣，充分暴露硬脑膜。将颅脑创伤仪的撞击头对准大鼠骨孔，使撞击头与硬脑膜表面紧密贴合，按下按钮，完成撞击。撞击参数设置：撞击头直径3 mm，撞击速度5 m/s，硬膜下陷深度2.5 mm，撞击时间持续500 ms。撞击完成后将大鼠头皮缝合，待麻醉复苏后将其放回笼中饲养。

对照组釆用同样的麻醉及手术操作，不经撞击处理。

1.4 治疗方法

VDH组分别于TBI造模后30 min、24 h、48 h腹腔注射VDH 1μg/kg[14]。VDH溶于5%二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)中。其余组在相同时间点腹腔注射等体积5%DMSO。

1.5 检测指标与方法

1.5.1 细胞凋亡检测

造模后3 d，每组取5只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛3～4 ml/kg麻醉大鼠，取全脑，海马区切片，按TUNEL检测试剂盒进行操作。①石蜡切片二甲苯浸洗透明5 min，共2次；②依次用梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)浸洗3 min；③组织用Proteinase K工作液处理15 min；④PBS漂洗5 min，共2次；⑤加TUNEL反应混合液50μl，暗湿盒中37℃恒温箱中反应1 h；⑥PBS漂洗3 min，共3次；⑦组织切片上加DAB底物50～100μl，25℃恒温箱中反应10 min；⑧PBS漂洗3 min，共3次；⑨苏木素复染，梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片；⑩光学显微镜下观察海马区凋亡细胞并计数阳性细胞。

1.5.2 Western blotting

造模后3 d，每组取5只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛3～4 ml/kg麻醉大鼠，断头取脑，提取海马组织进行定量。将40μg蛋白与2×上样缓冲液按体积1∶1比例混合，开水煮沸5 min，选择15%SDS-PAGE/5%积层胶上样，电泳，转膜，封闭2～3 h，加入兔抗LC3多克隆抗体、兔抗p62多克隆抗体及兔抗β-actin多克隆抗体，4℃摇床过夜，用TBST洗膜10 min，共3次；加入二抗，室温下孵育1 h，再次用TBST洗膜10 min，共3次；DAB显色，图像分析仪(美国BIO-RAD公司)测定光密度，计算目标蛋白与β-actin的比值进行定量分析。

1.5.3 Morris水迷宫测试

Morris水迷宫测试为至今应用最为广泛的研究空间学习记忆功能的方法[15]。所有大鼠在造模前通过训练，使大鼠学会游泳，找到安全岛的时间没有差异。在TBI后第5、6、7天进行实验。测试开始前，将直径12 cm、高28 cm，且黑色不透明的安全岛，随机放于水迷宫四个象限中的任一象限，加水至安全岛上方2 cm处，温度22～25℃。将大鼠随机放入四个象限，使大鼠头部朝向桶壁，找到安全岛的时间控制在60 s内。在水迷宫上方安置摄像探头，计算机自动记录、拍摄和统计大鼠从其他三个象限找到安全岛的轨迹和潜伏期。如果60 s内大鼠没有找到安全岛，将其放在平台上20 s，潜伏期记为60 s。

1.6 统计学分析

采用SPSS 20.0对实验数据进行统计分析。实验数据为计量资料者，采用(xˉ±s)描述，不同组别比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用SNK法。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 细胞凋亡

TUNEL阳性细胞呈棕黄色，细胞胞核着色。模型组TUNEL阳性细胞数显著多于对照组(P＜0.001)，VDH组TUNEL阳性细胞数显著少于模型组(P＜0.001)。见表1、图1。

2.2 LC3蛋白和p62蛋白表达

模型组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和p62表达均明显高于对照组(P＜0.01)，VDH组明显低于模型组(P＜0.01)。见表2、图2、图3。

2.3 Morris水迷宫测试

模型组逃避潜伏期明显长于对照组(P＜0.01)，VDH组逃避潜伏期短于模型组(P＜0.05)。见表3。三组大鼠第5、6、7天的平均游泳速度无显著性差异(P＞0.05)。见表4。

表1 三组TUNEL阳性细胞数

表2 三组海马组织内LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及p62表达

表3 三组水迷宫测试逃避潜伏期比较(s)

表4 三组在水迷宫测试平均游泳速度比较(cm/s)

图1 三组海马组织内细胞凋亡情况(TUNEL染色，400×)

图2 三组海马组织内LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比较

图3 三组海马组织内p62表达

3 讨论

本实验结果表明，VDH在水迷宫试验中显著降低TBI大鼠的逃避潜伏期，证明VDH的神经保护作用，与国内外多项研究相符[15-16]。

脑出血后的自噬由多个步骤组成，包括自噬的介导、自噬体的形成、自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体、自噬溶酶体的降解。自噬流是这些步骤在细胞内连续出现的动态过程，自噬流中的任一环节出现障碍自噬将无法完成其生物学功能。

LC3是酵母ATG8的同源物，定位于自噬体内外膜，参与自噬延长阶段[8]，其有LC3Ⅰ和LC3Ⅱ两种存在形式，LC3Ⅱ在自噬体形成中起着关键作用，其与LC3Ⅰ的比值被通常用作检测哺乳动物自噬活性的重要指标[9]。p62是一种指引泛素化蛋白进入自噬体进行降解的连接蛋白，可伴随自噬流一起被水解，当自噬流障碍时水平升高[17]。

本实验结果表明，TBI导致大鼠海马组织内自噬流的障碍，而VDH能够缓解TBI后自噬流的障碍，这或许是其在大鼠TBI后发挥神经保护作用的机制之一。

对应激状态下的肿瘤细胞给予自噬抑制剂氯喹干预后，促进肿瘤细胞死亡，提示自噬可以在应激状态下维持肿瘤和正常细胞的存活[18]。锌离子同样可以激活并增强自噬活动，清除海马区变构或错误折叠的β-淀粉样蛋白和tau蛋白，对防治海马损害引起的认知功能障碍有重要作用，说明激活自噬有益于疾病的恢复[19]。Zheng等[20]发现，脑缺血可以促进自噬体和自噬溶酶体形成，提高LC3ⅡmRNA和蛋白表达水平，而自噬可能会加重神经元损伤。但有学者利用敲除Atg7基因的小鼠造成脑缺血模型，自噬活动消失，可见细胞内大量蛋白质聚集和神经元死亡，说明自噬能够促进神经元的存活[21]。Sadasivan等[22]采用可控皮质冲击损伤装置制作脑外伤模型，发现急性脑外伤可以激活自噬，且自噬对脑功能的恢复具有促进作用。

以自噬机制为靶点治疗疾病，不仅涉及自噬对神经元的直接保护作用[23]，且与其对免疫反应[24]及凋亡[25]、坏死机制的影响有关。在疾病发生发展过程中，自噬与凋亡、坏死机制之间的复杂联系在学术界仍存在着诸多争议。本实验结果提示，自噬促进其神经功能恢复的机制或许与抑制神经元凋亡有关。

近年来，动物实验和临床试验表明，VDH治疗在TBI后发挥重要的神经保护作用[26-27]。另一方面，目前大部分学者更多地将VDH作为孕酮治疗的辅助手段进行研究[28]，而关于VDH单体治疗对TBI的神经保护分子机制研究还不够深入。本研究并未涉及VDH影响自噬及凋亡的具体作用途径及其分子机制，在今后研究中我们将引入激活剂或抑制剂进一步探讨VDH在发挥脑保护的作用机制。

综上所述，VDH治疗能够改善大鼠TBI后认知功能障碍，其分子机制与自噬的激活以及抑制神经元凋亡有关，VDH作为神经甾体，很可能成为一种颇有前景的TBI疾病治疗药物，其具有经济实惠、较易获取、不良反应少和能够长期应用等优点，有望为TBI及其并发症的治疗打开新思路。

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