荧光标记免疫层析技术 在食品安全检测中的应用研究进展

汤轶伟,张 宏,崔芷萌,焦雪晴,刘 欢,钟克利,刘秀英,高子媛,徐志祥,丁浩宸,励建荣,*

(1.渤海大学食品科学与工程学院,辽宁锦州 121013;2.山东华盛天同标准技术服务有限公司,山东济南 250102;3.山东农业大学食品科学与工程学院,山东泰安 271018;4.辽宁安井食品有限公司,辽宁台安 114100)

食物是人类赖以生存和繁衍的物质基础,食品安全问题关系到每个人的身体健康。随着食品工业及全球贸易的发展,除了传统的食品质量安全问题以外,由食品生产、加工新技术与新工艺带来的新的危害日益突出,主要表现为食品污染及非法添加事件频发、食源性疾病不断上升、食品造假案件接连发生。食品安全快速检测技术是食品安全保障的重要支撑，与食品安全仪器检测技术相比,食品快速检测技术具有检测时间缩短,实验准备、样品制备、操作过程简单等特点。

免疫层析技术(Immunochromatographic Assay,ICA)是20世纪末发展起来的结合免疫技术和色谱层析技术的一种分析方法,该方法具有特异性强、操作简单、快速等特点,广泛应用于临床诊断、环境监测、食品安全等重要领域[1-2]。传统免疫层析技术以胶体金为标记物,通过条带显色对目标物定性检测或半定量分析。该方法虽然简单快速,但灵敏度较差,难以准确定量[3-4]。荧光免疫层析技术作为一项新型免疫检测技术,既保留了传统胶体金试纸条的现场快速检测优点,又加入了荧光检测技术的高灵敏度特点,成为提高免疫层析方法检测性能的主要途径之一。本论文对荧光免疫层析技术原理、荧光标记物种类及荧光免疫层析技术在食品安全检测中的应用进行综述,并展望了未来发展趋势。

1 荧光免疫层析技术

荧光免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术。该技术以固定有检测线(包被抗体或包被抗原)和质控线(抗抗体)的条状纤维层析材料为固定相,测试液为流动相,荧光标记抗体或抗原固定于连接垫,通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。对于带有多个抗原决定簇的大分子抗原(蛋白、病毒、致病菌等),通常采用“三明治”型双抗夹心免疫层析方法,即待测物在流动相作用下先与荧光标记抗体结合,当到达检测线时再与包被抗体结合形成双抗夹心的“三明治”型(图1A)。对于只具有单一抗原表位的小分子抗原(农、兽药、违禁药物等),待测小分子抗原与荧光标记抗体结合后,由于空间位阻作用难以再与检测线上的包被抗体结合(图1B)。所以,具有单一抗原表位的小分子待测物多采用竞争免疫层析法检测。

图1 荧光试纸条示意图[5]Fig.1 Schematic diagram of fluorescence strip[5]注:A:“三明治”免疫层析试纸条;B:竞争免疫层析试纸条。

2 荧光标记物种类及荧光免疫层析技术应用

荧光免疫层析分析方法具有灵敏度高、稳定性好、受自然荧光本底干扰低等优点,成为食品质量安全快速检测分析研究的热点。目前,用于荧光免疫分析的标记物主要包括荧光素、量子点、上转换纳米粒子等。

2.1 荧光素免疫荧光层析技术

荧光素是指具有荧光特性的有机染料。1942年,Coons等首次报道了异氰酸荧光素标记抗体用于检测鼠组织切片中肺炎球菌抗原分布的研究,由此出现了免疫荧光技术。后来,为了改进异氰酸荧光素的性能,Rigggs等合成了性质稳定、毒性较低的异硫氰酸荧光素。自Marshall等改良了荧光抗体标记技术后,荧光免疫技术得到快速发展。目前,应用于荧光免疫分析的荧光素主要有以下5种:异硫氰酸荧光素、四乙烯基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、与酶作用后产生荧光的物质和镧系[6]。

宋春美等[7]采用异硫氰酸荧光素作为标记材料标记莱克多巴胺单克隆抗体,应用免疫层析技术研制莱克多巴胺荧光检测试纸条,并对其灵敏度、特异性、重复性进行了测定。研究结果表明,该免疫层析试纸条的检测限为1 μg/L,较同一抗体的胶体金试纸条的敏感性提高了10倍;与结构类似物交叉反应结果显示该方法具有良好的特异性;以不同批次的检测试纸对牛奶等样品中莱克多巴胺残留进行检测,结果一致性较高,重现性良好。该检测方法快速,能在10 min内显示结果。

荧光材料在免疫层析技术中的应用显著提高了该方法的检测性能。然而,有机染料标记物光照下易分解,易发生光漂白现象,具有浓度淬灭特征,影响了分析结果的准确性和可靠性[8]。将荧光素包裹于聚苯乙烯微球是提高荧光素分析性能的有效方法,Majdinasab等[9]以聚苯乙烯/Eu3+纳米粒子标记赭曲霉毒素A(OVA)抗体作为荧光探针,以赭曲霉毒素/牛血清白蛋白偶联物和兔抗鼠抗抗体分别喷涂于纤维素膜上作为检测线和质控线构建了荧光免疫层析检测方法,最优条件下该方法对实际样品的检测限为1 μg/kg。Tang等[10]对比了聚苯乙烯包裹Eu3+配合物荧光微球与胶体金标记物在免疫层析分析中的稳定性,结果显示：聚苯乙烯荧光微球具有较高的稳定性和灵敏度,更适合用于免疫层析分析。

2.2 量子点免疫层析技术

量子点(Quantum Dots,QDs)是一种半导体荧光纳米颗粒,直径通常在1～20 nm之间,一般由II-VI或III-V族元素组成[11-12]。与有机染料荧光标记材料相比,量子点具有斯托克斯位移大,激发光谱宽、发射光谱窄,荧光发射强度强而稳定,量子产率高,耐光漂白[13],成为分析检测领域研究的新热点。

白亚龙[14]以红色CdTe量子点为代表,通过免疫层析法探讨了量子点与小鼠lgG抗体的最佳偶联方式,结果显示以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合物(质量比3∶4)为偶联剂制备的荧光探针性能优于直接偶联和以DEC和NHS单独作为偶联剂偶联得到的荧光探针;采用硅烷偶联试剂APTES氨基化的二氧化硅纳米粒子(50～500 nm)为载体,通过偶联试剂EDC与NHS将其与CdTe量子点偶联,制备得到了高强度的荧光微球;初步研究结果表明：荧光免疫层析方法的灵敏度比胶体金免疫层析体系高4～20倍。

Nardo等[15]将羧基化量子点通过活化酯方法与伏马毒素(Fumonisins)抗体偶联作为荧光标记探针,建立了玉米中伏马毒素B1荧光免疫层析试纸检测方法,测定过程如图2所示。实验结果显示,该方法的检测限为2.8 μg/L,实际样品的检测范围为30～3500 μg/kg,检测分析时间(包括样品处理)为22 min。在相同检测条件下,量子点荧光免疫层析试纸检测方法的灵敏度高于胶体金试纸检测方法，但是由于荧光信号需在试纸条干燥后才能稳定,所以用时相对较长。

图2 量子点免疫层析吸附测定过程示意图[15] Fig.2 Schematic description of QD-based immunochromatographic strip test in dipstick format[15]

胡华军等[16]采用巯基丁二酸修饰CdTe/ZnSe核壳量子点,在N-羟基琥珀酰亚胺作用下与抗克伦特罗多克隆抗体偶联,通过凝胶电泳和斑点杂交实验验证了量子点与抗体的偶联效果。将合成的量子点与抗体的偶联物为荧光探针制备了用于检测克伦特罗的免疫层析试纸条,其灵敏度为1 ng/mL,通过ELISA方法验证表明：该试纸条可用于实际样品中克伦特罗残留的快速测定。

周耀锋等[17]采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺法将抗赭曲霉毒素A腹水与CdTe/ZnSe量子点偶联作为荧光探针,以牛血清白蛋白-赭曲霉毒素偶联物及驴抗鼠二抗喷涂于硝酸纤维素膜上形成检测线和质控线,并建立了基于检测线/质控线荧光强度比值的免疫层析试纸条高灵敏度、快速定量检测玉米中赭曲霉毒素的方法。研究结果表明,该量子点荧光试纸条定量检测赭曲霉毒素的线性范围为0.05～1.0 ng/mL,玉米提取液中赭曲霉毒素的检出限为0.05 ng/mL,单个样品的检测时间为10 min。40个实际玉米样品检测结果表明,量子点荧光微球试纸条与ELISA检测赭曲霉毒素的结果具有良好的相关性。

Sun等[18]通过碳二亚胺法将微囊藻毒素抗体与水溶性的CdTe量子点偶联作为探针,建立了检测微囊藻毒素的荧光免疫层析快速检测方法。最优条件下,该检测方法的线性范围为:25～5 μg/L(R2=0.9901),测定限为0.1 μg/L,重现性好,变异系数为10%,可实际检测水环境中微囊藻毒素含量测定。

Yu等[19]以CdTe/CdS量子点与EscherichiacoliO157∶H7抗体偶联喷涂于玻璃纤维结合垫,以EscherichiacoliO157∶H7抗体和羊抗兔抗抗体喷涂于硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线构建荧光免疫层析试纸条及检测方法。最优条件下,该方法的检测限位104CFU/mL,与其它Escherichiacoli株系无交叉反应。该试纸条可在室温避免条件下保存35 d,检测方法快速(小于12 min)、灵敏,可定量检测食品样品中的细菌含量。

为了提高荧光免疫层析试纸条的检测通量,提高测定结果的准确性,Taranova等[20]将氯霉素抗体、链霉素抗体、氧氟沙星抗体分别与具有不同发射波长的量子点偶联,并以此为荧光探针构建了可同时检测牛奶中三种抗生素的荧光免疫层析试纸条,建立了不同抗生素浓度与荧光强度之间的线性关系,实际样品检测结果如图3所示。研究结果表明,最优条件下该试纸条对氧氟沙星的检测限为0.3 ng/mL,氯霉素的检测限为0.12 ng/mL,链霉素的检测限为0.2 ng/mL,比使用同一对应抗体建立ELISA方法的检测限低80～200倍,对实际牛奶样品的添加回收率为92%～101%。

图3 检测3种抗生素类药物量子 点荧光免疫层析试纸检测结果[20]Fig.3 Immunochromatographic test for testing samples in the absence of analytes(control experiment)[20]注:a:不含有任何药物,b:含有氧氟沙星(200 ng/mL),c:含有氯霉素(10 ng/mL),d:含有链霉素(500 ng/mL)。

Wang研究团队采用微乳液技术将量子点CdSe/ZnS包裹起来形成量子点微球,然后将该微球与玉米烯酮及黄曲霉毒素B1抗体偶联作为竞争性荧光探针。与上述免疫层析试纸不同,该荧光探针不喷涂于试纸条上,而是在应用时将其与样品提取液混合后滴于样品垫,在层析作用下与硝酸纤维素膜上喷涂的包被抗原(检测线)及羊抗鼠抗抗体(质控线)竞争结合。研究结果表明,制备的量子点微球比相对应量子点的荧光强度可增强千倍以上,而且检测灵敏度得到显著提高[21-22]。综合比较荧光微球与量子点荧光免疫层析检测方法,荧光微球免疫层析检测方法的检测限更低,准确度、精确度、重现性更好[23]。

石墨烯(Graphene)是一种由碳原子以sp2杂化方式形成的蜂窝状准二维材料。氧化石墨烯(Graphene Oxide,GO)是石墨烯的氧化物,在水中具有优越的分散性,可通过荧光共振能力转移方式使荧光物质发生荧光淬灭。Morales-Narváez等[24]利用氧化石墨烯可淬灭荧光的特性用于荧光免疫层析检测中，作为病原菌显示剂,该研究将量子点CdSe@ZnS与抗体偶联物(Ab-QDs)及量子点CdSe@ZnS分别喷涂于试纸的检测线和质控线。检测时若测试液中含有目标物,则目标物与检测线上的抗体结合,阻止氧化石墨烯淬灭检测线上量子点发出的荧光;若测试液中没有目标物,则氧化石墨烯淬灭检测线上量子点产生的荧光。该实验中质控线上量子点产生的荧光不论测试液中是否含有目标物都被氧化石墨烯淬灭。检测示意图如图4所示。研究结果表明,该方法具有较高的特异性和灵敏度,对瓶装水及牛奶样品中大肠杆菌的检测限为100 CFU/mL。

图4 以氧化石墨烯为病原菌显示剂的 荧光免疫层析病原菌检测示意图[24]Fig.4 Photoluminescent lateral flow test revealed by grapheme oxide(GO)for pathogen detection[24]

2.3 上转换纳米粒子免疫层析技术

上转换发光是指反-斯托克斯发光,即用低能量的红外或近红外光激发，从而发射出高能量的紫外或可见光[25]。上转换发光大都发生在掺杂稀土离子的化合物中,NaYF4是目前上转换发光效率最高的基质材料。与荧光染料、量子点相比,上转换纳米粒子毒性低、灵敏度高、稳定性好,可避免由于样品中具有荧光特性基质对检测结果的影响,是目前理想的荧光标记物之一[26]。

Wang等[27]将抗克伦特罗抗体与醛基修饰的上转换纳米粒子偶联作为荧光探针喷涂于连接垫,以克伦特罗-牛血清白蛋白偶联物和抗抗体分别包被于硝酸纤维素膜上，作为检测线和质控线构建上转换荧光免疫层析试纸,图5为不同克伦特罗浓度质控线和检测线上转换荧光强度变化。研究结果表明,最优条件下该荧光免疫层析试纸的目视检测限和计算检测限均为0.1 ng/mL,检测时间为10 min,样品的添加回收率为73.0%～92.2%。以上转化纳米粒子作为免疫层析技术中的荧光标记物可简化实施现有的样品前处理方法,这是因为样品基质或其它具有荧光性质的干扰物在红外或近红外光激发下不产生发射光谱,对检测结果影响较小。

图5 不同克伦特罗浓度质控线 和检测线上转换荧光强度变化[27]Fig.5 The upconversion fluorescence intensity of control line and test line in the presence of varying concentrations of clenbuterol[27]

王瑜等[28]将氨基修饰的NaYF4:Yb,Er上转换纳米粒子与己烯雌酚单克隆抗体偶联为免疫层析荧光探针,分别以喷涂于硝酸纤维素膜上的己烯雌酚-牛血清白蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体为检测线和质控线,建立了上转换免疫层析荧光快速定量检测己烯雌酚残留方法。实验结果表明,该试纸条线性范围为25～1000 ng/mL,检出限为20.84 ng/mL,单个样品检测时间为15 min,批内批间变异系数小于10%,牛奶样品的添加回收率为90.1%～115.2%,相对标准偏差小于5%,为牛奶中己烯雌酚残留快速定量检测提供了新的测定方法。

王浩然等[29]基于上转换免疫荧光单靶标检测试纸,成功研制出对乙型副伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌O1和O139群、大肠杆菌O157、甲型副伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌等10种食源性致病菌具有现场检测能力的十通道试纸盘检测系统,可满足食品样品增菌检测和腹泻样本直接检测的灵敏度要求。刘晓等[30]以上转换发光材料为标记物,建立了可对奶制品中黄曲霉毒素M1进行现场快速检测的上转换荧光免疫层析快速定量检测方法。最优条件下,该方法对奶粉和牛奶中黄曲霉毒素M1的检测灵敏度分别达到0.1 ng/mL和0.3 ng/mL,每个浓度重复测量的变异系数小于15%。该研究构建的上转换荧光免疫层析试纸条检测方法操作简便快捷、样品前处理简单、具有良好的检测敏感性和特异性,对实际样品的耐受性较好,可满足食品安全中对现场快速检测的需求。

Liu等[31]以核壳型NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4纳米颗粒与头孢氨苄抗体偶联，作为荧光探针喷涂于结合垫,以头孢氨苄-牛血清白蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体分别喷涂于硝酸纤维素膜上，作为检测线和质控线。最优条件下,建立的上转换荧光免疫层析方法的目测检测线为10 ng/mL,定量检测的线性范围为0.5～100 ng/mL。

Zhao等[32]通过水热反应法合成了羧基修饰的β-NaYF4:Yb,Er纳米颗粒,在EDC和NHS作用与抗体偶联作为荧光探针。最优条件下,建立的鳗弧菌MVM425上转换荧光免疫层析检测方法的线性范围为103～109CFU/mL,相关系数为0.994,检测限位102CFU/mL,比已报到的酶联免疫检测方法低100倍。

3 展望

免疫层析技术具有特异性强、灵敏度高、简便快速、无需特殊昂贵仪器等优点,但传统以胶体金标记的免疫层析检测方法灵敏度低、难以定量的问题已限制了该方法的应用。荧光免疫层析技术的发展在一定程度上解决了传统胶体金标记免疫层析出现的问题,迅速成为食品安全快速定量检测领域研究的热点。

荧光染料、量子点、上转换纳米粒子荧光标记免疫层析技术的发展及其在食品安全检测中的应用，为我国的食品安全提供了新的技术支撑。为了荧光免疫层析技术在食品安全快速检测领域更好的应用,该技术可在以下方面拓展深入研究:核酸适配体是一种具有特异分子识别性能的新型分子识别元件,比生物抗体合成更容易,稳定性更好,研究核酸适配体等新型分子识别元件在荧光免疫层析中应用具有重要意义;多残留广谱荧光免疫层析技术仍需深入研究;研制小型、便携式、性能优良的荧光免疫层析试纸配套检测仪器,提高荧光免疫层析定量检测方法的准确度和灵敏度,促进仪器检测方法的应用简便性,降低检测成本;研发提高抗体-荧光标记物探针抗干扰试剂,降低假阳性或假阴性现象的发生;建立简单、快速、高效的样品前处理方法,为食品安全现场快速定量检测奠定基础。

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