低频静电场辐射对酿酒酵母生长代谢的影响

蔡杏华,任浩锋,蒙永双,钟 娟,唐乾玉,黄婧婕,林日辉,,3,*

(1.广西民族大学海洋与生物技术学院,广西高校微生物与植物资源利用重点实验室,广西南宁 530006;2.广西民族大学化学化工学院,生物转化与过程反应重点实验室,广西南宁 530006;3.广西民族大学化学化工学院,广西多糖材料与改性重点实验室培育基地,广西南宁 530006)

低频静电场(LFEF)是指频率在0～300 Hz之间的静电场,主要由家用电器、输电线路和电子设备等产生,是日常生活中接触最多的一类低频静电场[1]。自1980年Miller等[2]发现低频静电场的感应强度与儿童的癌症发病率有关后,电场辐射导致的生物学效应受到了广泛的关注,此后低频静电场在2002年被国际癌症研究所列为可疑致癌物之一[3]。

目前对于低频静电场的研究已从简单的流行病学调查转向了细胞和分子水平。Ghodbane S[4]和Amara S等[5]的研究发现低频电场辐射可改变小鼠大脑中谷胱甘肽水平并影响着超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶的活性,同时引起一定程度的基因损伤。李思思等[6]研究发现,低频静电场辐射可降低果蝇的生殖能力和寿命,影响子代性别决定。但也有研究发现,低频静电场辐射对单核巨噬细胞(THP-1)内活性氧水平并没有显著影响,也没有检测到DNA损伤的发生[7]。

迄今为止,电场辐射作用引起的生物学效应尚缺乏令人信服的依据,其作用机理和量效关系仍缺乏系统的研究,因此,继续深入研究低频电场辐射对细胞的影响机制,对低频静电场辐射的风险评估与开发应用有着十分重要的意义。

为了进一步研究低频静电场辐射对细胞本身以及胞内外代谢的影响,本实验以酿酒酵母为实验对象,采用低频静电场对其进行辐射处理,通过扫描电镜、流式细胞仪、酶标仪、分光光度计等手段对细胞的形状、生长趋势、葡萄糖代谢速率、胞内外蛋白的表达量以及胞内酶的活性进行测定分析,对比辐射生长与自然生长的差异,为低频静电场辐射导致的生物学效应,以及低频静电场在实际生活中的应用提供进一步的科学依据和理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

酿酒酵母 河北马利食品;YEPD培养基(1%酵母粉,2%葡萄糖,2%蛋白胨) 北京索莱宝;M5酵母蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒 北京聚合美;乙醇脱氢酶(ADH)、牛血清蛋白biosharp、β-NAD 上海楷洋;其他常规试剂均为国产AR级。

电场发生装置 DENBA-08,功率为3.3 W,频率为60 Hz,电场强度为2.5 mV/m,有效辐射范围8 m3，日本株式会社;BD Accuri C6型流式细胞仪 BD公司;SUPRA 55 Sapphire型场发射扫描电子显微镜 德国卡尔蔡司;TU-1901型紫外分光光度计 北京普析仪器;HZ250LBG型恒温摇床 武汉瑞华仪器;L400型高速冷冻离心机 日本日立;EPS301型电泳系统 Amershan Biosciences;GI54D型高压蒸汽灭菌锅 厦门致微仪器;BS-1101酶标仪 南京德铁。

1.2 实验方法

1.2.1 酿酒酵母的形态观察 在YEPD培养基中加入2%的琼脂粉制成固体培养基,然后涂布接种酿酒酵母,随机将培养皿分成两组,辐射组静置于辐射板上进行持续辐射生长(如图1a所示),自然组则放置于桌面进行自然生长(如图1b所示),平板培养72 h(可观察到明显的酿酒酵母菌落),挑取适量菌落,无菌水冲洗,取50 μL菌液滴于载玻片上,加入等体积的美蓝染液进行染色30 min,制成玻片,在荧光拍照显微镜下观察其形态。

挑取上述培养平板的菌体适量,制成电镜观察样品,不经过任何化学处理,然后采用场发射扫描电子显微镜对菌体的表面形态进行观察和对比。

图1 酿酒酵母的生长环境Fig.1 The growth environment of S. cerevisiae注:a、c:辐射生长;b、d:自然生长。

1.2.2 酿酒酵母的生长趋势对比 酿酒酵母的发酵培养选用YEPD液体培养基,在250 mL的三角瓶中,装液量为100 mL,接种量为2%。将酿酒酵母随机分成两组(每组3个平行),一组进行静置持续辐射生长,另一组自然静置生长(辐射处理环境如图1c、d所示),培养温度控制在24～26 ℃之间,每隔2 h取样并采用比浊法[8]测定OD600 nm,以横坐标为时间,纵坐标为吸光值,绘制酿酒酵母的生长曲线,并计算各自的比生长速率。

比生长速率的计算式为:

式中,μ:比生长速率;n:经过时间t后增加的世代数;N0:开始时培养液OD600 nm值;Nt:经过时间t后培养液的OD600 nm值;Tt与T0分别代表t时刻的时间和初始时间。

1.2.3 流式细胞仪对酿酒酵母的检测分析 以YEPD液体培养基对酿酒酵母进行培养,每隔4 h取1 mL培养液用无菌水稀释,随后用尼龙网(孔径为33 μm)滤去大颗粒物质,然后通过流式细胞仪进行检测分析和计数,实验结果采用BD Accuri C6软件进行分析。其原理为:将细胞颗粒列队通过激光检测,由光信号转化为电脉冲信号,接着转化为数字信号,因此可检测出细胞的大小和数量[9]。

1.3 葡萄糖的代谢分析

采用DNS法[10]测定葡萄糖的浓度,每隔4 h取样1 mL,采用0.22 μm的微孔滤膜滤去菌体和不溶物,样品经无菌水稀释50倍,然后按照1∶1的体积之比与DNS试剂充分混匀,100 ℃水浴加热5 min,冷却至室温后,在540 nm波长下检测。葡萄糖的浓度计算根据标准曲线y=7.456x-0.3676(R2=0.9995),其中y为540 nm下的吸光值,x表示葡萄糖的浓度。

1.4 蛋白质分析

1.4.1 胞内可溶性蛋白的提取与浓度测定 可溶性蛋白的提取按照M5酵母蛋白抽提试剂盒说明书进行。酿酒酵母发酵培养16 h后(对数生长期末期),经过冷冻离心收集菌体(8000 r/min,20 min,4 ℃)。将菌体按照0.5 g湿重加入2 mL蛋白抽提液(试剂盒成分之一),采用漩涡振荡器(1000 r/min,4 ℃)进行振荡抽提30 min,然后在14000 r/min,4 ℃条件下离心收集上清液即为粗蛋白液[11]。蛋白浓度的测定采用Bradford法[12],利用BCA蛋白浓度测定试剂盒,在96微孔板中制备样品,通过酶标仪进行快速检测。

1.4.2 蛋白质的电泳分析 将上述粗蛋白液统一稀释至相同浓度(2 mg/mL),通过SDS-PAGE电泳[13]分析,分离胶浓度为12%(分离范围12～150 kDa),上样量为10 μL,电泳的结果采用凝胶成像仪进行拍照和分析。

1.4.3 胞内乙醇脱氢酶(ADH)的活性分析 乙醇脱氢酶(ADH)的活性测定参考文献方法[14],在1 mL的反应体系中,加入0.7 mL浓度为50 mmol/L、pH=8.8的Tris-HCl缓冲液,0.1 mL乙醇(1 mol/L),0.1 mLβ-NAD(0.2 mol/L),最后加入0.1 mL的粗蛋白液(培养16 h后提取)充分混匀,采用紫外分光光度计在340 nm波长下迅速进行时间扫描,分别记录30、60、90、120 s的吸光值,并计算单位时间内的吸光值变化量,根据标准曲线y=0.0999x+0.0045(R2=0.9999)计算乙醇脱氢酶(ADH)的活性。式中y为酶在单位时间内的吸光值变化量,x为酶的活力(U)。

2 结果与分析

2.1 形态观察

图2 酿酒酵母的光学显微镜观察(1000×)Fig.2 Optical microscopic observation of S. cerevisiae(1000×)注:a：自然生长;b：辐射生长。

光学显微镜的观察结果如图2所示,酵母细胞的形态、大小从整体来看并无显著差异,但经过辐射处理的酿酒酵母在显微镜下可观察到染色程度更深,菌体更为密集。此外,通过图3的扫描电镜观察结果可知,经过辐射生长的酿酒酵母出现了明显的细胞凹陷,而自然生长的酿酒酵母仍然呈现表面光滑,无明显形状变异或畸形的现象,且经过辐射生长的酿酒酵母芽体数量明显较多,这表明辐射生长的酿酒酵母出芽生殖频繁,这与生长趋势中所呈现的结果一致。所以推测认为,低频静电场的辐射作用一定程度上改变了细胞原有的代谢水平,加快了其生长代谢过程,使胞内外的物质交流加快,导致细胞膜的通透性加大,细胞壁的保护功能相对变得脆弱,因此容易受到电场的辐射作用影响，致使细胞凹陷甚至被击穿[15]。

图3 酿酒酵母的电镜图(5000×)Fig.3 Electron microscopy of S.cerevisiae(5000×)注:a：自然生长;b：辐射生长。

2.2 生长趋势

如图4所示,静电场辐射生长的酿酒酵母自2 h后开始进入对数生长期,而自然生长的酿酒酵母则在4 h后开始进入对数生长期。比较对数生长期两者的比生长速率可知,辐射生长的最大比生长速率为0.276,自然生长的最大比生长速率为0.241,前者比后者提高了14.5%。这说明低频静电场辐射对酿酒酵母的生长过程具有显著的促进效应(p<0.05)。

图4 酿酒酵母的生长曲线Fig.4 Growth curve of S. cerevisiae

2.3 流式细胞仪分析

流式细胞仪对酿酒酵母细胞生长过程的检测结果如图5所示。当时间为4 h时,两种条件下生长的酿酒酵母在菌体数量和大小上无明显差异。当时间达到8 h时,经过辐射生长的酿酒酵母最先出现了“二次峰”,这表明辐射生长的酿酒酵母已经开始大量进行出芽生殖,产生了芽体,而此时自然生长的酿酒酵母却无明显变化,直到16 h时自然生长的酿酒酵母才出现“二次峰”。这说明低频静电场辐射明显促进了酿酒酵母的生长、繁殖速度,这与生长曲线的结果一致。

图5 酿酒酵母的流式细胞仪分析Fig.5 Flow cytometry analysis of S. cerevisiae注:a:自然生长,b:辐射生长；横坐标代表细胞大小的分布情况，纵坐标代表细胞数量。

2.4 葡萄糖消耗速率对比

酿酒酵母对葡萄糖的消耗曲线如图6所示,两种条件下生长的酿酒酵母在时间达到36 h时,葡萄糖的剩余量均已逐渐耗尽,然而在时间为4～24 h之间,辐射生长的酿酒酵母对葡萄糖的消耗速率更快,在16 h时比自然生长提高了15.64%，这与酿酒酵母生长曲线中所表现的结果一致,由此可知,低频静电场辐射可以显著加快酿酒酵母的生长、代谢速率,对其生长代谢表现出了正向的促进效应,这与林康伟等[1]的研究结果相类似。

图6 葡萄糖的消耗曲线Fig.6 Consumption curve of dextrose

2.5 蛋白质的分析结果

采用Bradford法经过酶标仪快速检测得到自然生长的酿酒酵母胞内可溶性蛋白浓度为(10.71±0.017) mg/mL,辐射生长测得的胞内可溶性蛋白浓度为(10.52±0.005) mg/mL,由此可知,两者的胞内可溶性蛋白总量相差很小(1.81%),低频静电场的辐射作用对其胞内总可溶性蛋白的表达量没有显著影响(p>0.05)。

然而,从图7的电泳分析结果可知,两种条件生长的酿酒酵母尽管从电泳条带的整体分布来看十分相似,但分子量在12～20、20～30、50～80 kDa之间时，两种条件下的电泳条带分布存在一定差异(如图7所圈出位置)。这些结果表明,经过低频静电场辐射的酿酒酵母,其胞内可溶性蛋白的种类可能发生了一定的变化,这可能是由于低频静电场的持续辐射作用,影响了酿酒酵母蛋白质的正常调控与表达[16]。

图7 胞内可溶性蛋白的电泳分析Fig.7 SDS-PAGE analysis of the intracellular soluble protein注:M:标准品;1、2:辐射生长;3、4:自然生长。

2.6 胞内乙醇脱氢酶(ADH)的活性分析

对酿酒酵母胞内乙醇脱氢酶(ADH)的活性进行测定分析的结果表明,自然生长条件下测得胞内乙醇脱氢酶比活力为9.66 U/mg,辐射生长时测得胞内乙醇脱氢酶比活力为10.36 U/mg,后者相比自然生长提高了7.25%。这说明低频静电场辐射对酿酒酵母胞内酶的活性或酶的合成具有一定的促进作用。这与杨生等[17]采用电场辐射对柠条种子的萌发和胞内酶活性研究结果相类似。

3 结论

由扫描电子显微镜所观察到的结果可知,低频静电场辐射可使酿酒酵母的细胞表面发生不同程度的凹陷现象。此外,低频静电场辐射还可以促进酿酒酵母的生长和葡萄糖代谢速率,对其生长和代谢过程具有显著的促进效应。

蛋白质电泳分析的结果表明,辐射生长与自然生长条件提取的可溶性蛋白,在分子量为12～20、20～30、50～80 kDa之间时,两种条件下的电泳条带分布存在一定差异,这表明低频静电场辐射可影响酿酒酵母胞内可溶性蛋白质的合成或表达。此外,低频静电场对酿酒酵母胞内乙醇脱氢酶的活性或合成量具有一定的促进作用。

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