CEUS定量评估大动脉粥样硬化性脑卒中患者易损斑块及其与循环血白细胞的相关性

李朝军，白 云，李万斌，高 峰， 匡 祎，杜联芳，罗向红>

(1.上海交通大学附属第一人民医院超声科，2.超声心动图室，上海 200080)

大动脉粥样硬化性脑卒中(large artery atherosclerosis stroke, LAAS)与颈动脉斑块易损性密切相关[1]，且斑块内炎性活动在LAAS的发生、发展及转归中扮演重要角色[2]。最新“外向内”学说[3]认为循环血内炎细胞通过新生血管蔓延，可导致斑块内炎性活动，循环血白细胞与斑块内新生血管(intraplaque neovascularization, IPN)可能具有相关性。本研究采用CEUS观察LAAS患者颈动脉IPN，评价CEUS定量参数与循环血白细胞间的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2016年6月—2017年6月经头颅CT或MRI证实的首发LAAS患者62例(LAAS组)，男48例，女14例，年龄53～80岁，平均(67.7±8.8)岁。入组标准：①首次发生脑梗死，且发病时间<7天；②斑块厚度>2.0 mm，多个斑块时选择最大者；③无钙化或钙化较少；④脑卒中罹患血管同侧颈动脉斑块。排除标准：①造影剂禁忌证，如过敏，急性心内膜炎、急性心力衰竭及不稳定型心绞痛等；②短暂性脑缺血发作；③近期活动性出血史，或伴恶性肿瘤、血液病等。选取同期住院且年龄、性别匹配，无心脑血管事件发生史的动脉硬化患者54例为对照组，男42例，女12例，年龄51～79岁，平均(64.7±6.7)岁。所有受检者检查当天停服降压药，禁止吸烟、饮酒或咖啡24 h。本研究经我院医学伦理委员会批准，受检者均签署知情同意书。

1.2 仪器与方法 检查当天清晨空腹静脉采血，检测空腹血总白细胞、中性粒细胞和淋巴细胞计数，计算中性粒细胞/淋巴细胞比。

采用Siemens Sequoia 512和S 2000彩色多普勒超声诊断仪，探头9L4，频率5～9 MHz，内置高频超声造影技术，工作站内置QontraXt定量分析软件。

颈动脉超声检查[4-5]：嘱受试者平卧静息10 min。采用高频超声检查双侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉及椎动脉，记录颈动脉斑块个数及分布范围，评估颈动脉狭窄程度。随后选择优势斑块(斑块位于颈动脉窦部或颈内动脉起始部远侧壁)行CEUS。造影模式设置：机械指数0.06～0.08，CPS增益0 dB，焦点2～3 cm。超声造影剂采用声诺维，经肘静脉注射2.5 ml，随后注入5 ml生理盐水。连续采集90 s 动态图像，存储供脱机分析。

1.3 CEUS定量分析 参照Li等[6]的研究方法，将CEUS动态图像导入QontraXt软件，由1名超声医师盲法观察图像，描记斑块感兴趣区，不确定时邀请另1名超声医师并协商达成一致意见，定量分析斑块时间-强度曲线(time-intensity curve, TIC)和TIC曲线的伽马拟合曲线(fitting curve, FC)，记录TIC曲线中峰值强度(peak, TIC-P)及强度均值(mean, TIC-M)，FC曲线中峰值(peak， FC-P)、锐度(sharpness, FC-S)和曲线下面积(area under the curve, FC-AUC)。1周后随机调取10例受试者的CEUS图像，重复测量FC-P和FC-AUC，行重复性检验。

1.4 统计学分析 采用SPSS 13.0统计分析软件，计量资料以±s表示。采用两样本t检验比较2组间循环血白细胞指标与CEUS诸参数。以Blant-Altman分析CEUS参数FC-P和FC-AUC的重复性。采用Pearson相关分析观察CEUS诸参数与循环血白细胞指标间的相关性。以CEUS诸参数为因变量，循环血白细胞各指标为自变量，行多元线性回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 循环血白细胞指标比较 LAAS组总白细胞计数、中性粒细胞计数及中性粒细胞/淋巴细胞比均高于对照组，而淋巴细胞计数低于对照组(P均<0.05)，见表1。

2.2 颈动脉斑块CEUS参数比较 于所有受检者均成功获取1个优势斑块完成CEUS检查(图1)。LAAS组TIC-P、TIC-M、FC-P、FC-S和FC-AUC值均大于对照组(P均<0.05)，见表2。

2.3 颈动脉斑块CEUS参数与循环血白细胞指标的相关性 中性粒细胞计数与FC-S、FC-AUC值呈正相关(r=0.261、0.298，P均<0.05)。淋巴细胞计数与TIC-P、TIC-M、FC-P值呈负相关(r=-0.291、-0.263、-0.270，P均<0.05)。中性粒细胞/淋巴细胞比与FC-S、FC-AUC值呈正相关(r=0.532、0.739，P均<0.05)。

2.4 多因素析 多因素分析显示总白细胞计数是TIC-P的独立影响因素，中性粒细胞/淋巴细胞比是FC-AUC的独立影响因素(P均<0.05)，见表3。

2.5 重复性检验Blant-Altman分析显示FC-P和FC-AUC两次测值的差值与均值呈一致性改变(图2)。

3 讨论

动脉粥样硬化斑块破裂是导致急性缺血性卒中的主要病因[7]，而斑块内慢性炎症和IPN是易损斑块破裂的重要特征。循环血白细胞计数和中性粒细胞/淋巴细胞比值的变化可反映机体炎性状态，并与斑块内炎性活动相关，但与IPN的相关性尚未明确。分析斑块IPN与循环血白细胞间的相关性有利于进一步认识斑块内炎性活动机制，预警斑块易损性。既往“内向外”假说[8]认为斑块内炎症的起因在于单核细胞黏附于内皮细胞，引发由内向外的炎性反应，而斑块内炎性状态和斑块易损性与循环血白细胞变化无相关性。本研究中LAAS组总白细胞计数、中性粒细胞计数和中性粒细胞/淋巴细胞比值均高于对照组，提示LAAS斑块易损性可能与循环血白细胞或中性粒细胞/淋巴细胞比值变化相关。外膜滋养血管是内外膜间沟通的主要途径，也是IPN的主要来源[9]。研究[10]表明，外膜也可能在斑块进展中发挥关键作用。依据新“外向内”学说[11]，斑块内炎性活动首先发生于外膜层，随后通过外膜滋养血管和IPN由外向内蔓延所致[12]，提示机体炎性状态可致斑块易损性增加。

表1 2组循环血白细胞指标比较(±s)

表1 2组循环血白细胞指标比较(±s)

组别总白细胞计数(×109/L)中性粒细胞计数(×109/L)淋巴细胞计数(×109/L)中性粒细胞/淋巴细胞比LAAS组(n=62)7．05±2．334．59±1．721．67±0．542．59±1．40对照组(n=54)6．01±1．823．71±1．591．99±0．912．11±1．68t值2．2352．409-1．9294．479P值0．0280．0180．047<0．001

表2 2组颈动脉斑块CEUS参数比较(±s)

表2 2组颈动脉斑块CEUS参数比较(±s)

组别TIC⁃P(dB)TIC⁃M(dB)FC⁃PFC⁃S(s-1)FC⁃AUCLAAS组(n=62)55．08±14．5725．29±8．8925．24±8．920．71±0．2717．22±8．38对照组(n=54)42．92±14．6321．88±8．1523．89±8．090．20±0．114．40±1．97t值9．6281．9861．9958．4897．292P值<0．0010．0460．041<0．001<0．001

表3 颈动脉斑块CEUS参数与危险因素的多元线性回归分析[回归系数(标准回归系数)]

图1 患者男，67岁，大动脉粥样硬化性脑卒中，患侧颈动脉斑块声像图 A.灰阶图； B.能量图； C.CEUS示斑块内新生血管(箭)

图2 FC-P和FC-AUC的2次测值Bland-Altman分析 A.FC-P测值； B.FC-AUC测值

斑块发生、发展和转归的中心环节是IPN形成。既往研究[13]证实，CEUS是定量评估动脉外膜滋养血管和IPN的有效手段。本研究中LAAS组颈动脉斑块CEUS定量参数均大于对照组，提示LAAS颈动脉斑块IPN增多，斑块稳定性差，发生心脑血管事件风险增加；分析原因，可能为斑块内新生血管细胞间隙大、基底膜不完整、平滑肌细胞少和发育不成熟而易出血，最终导致斑块破裂和发生心脑血管事件[14]。声诺维为血池显像剂，其对比信号强度可反映组织微血管的多寡[15]。目前评估IPN主要通过肉眼观察进行半定量分级，但斑块不同断面和直径小于50 μm的IPN(视觉分辨率≥50 μm)均可影响斑块易损性的分级。基于计算机图像分析的QontraXt软件可定量检测CEUS的对比信号强度，其参数TIC-P、TIC-M和FC-P均可定量反映斑块内新生血管形成。本研究中LAAS组TIC-P、TIC-M和FC-P均高于对照组，提示LAAS斑块微血管密度相关[16]；反映组织血液灌注量的参数FC-AUC亦增高，提示斑块IPN增多，血液灌注量增大[17]。本研究1周后随机调取10例受试者的CEUS图像，检验FC-P和FC-AUC的重复性，结果表明定量分析软件重复性好，其定量参数客观、准确[15]。

外膜中新生滋养血管是抗原、细胞因子和趋化因子转运的通道，也是斑块内炎性活动和IPN形成的桥梁[18]，且外膜是淋巴组织和淋巴细胞积聚的主要部位。研究[19]表明，外膜滋养血管与斑块内炎性活动密切相关。本研究发现中性粒细胞、淋巴细胞及中性粒细胞/淋巴细胞比与CEUS诸参数相关，提示斑块内炎性活动与循环血白细胞相关，为“外向内”学说提供了新的证据。本研究还发现LAAS组增高的循环血总白细胞计数和中性粒细胞/淋巴细胞比是CEUS定量参数的独立影响因素，提示循环血白细胞计数增加或中性粒细胞/淋巴细胞比值增大可导致斑块内炎性活动，促进斑块IPN形成、易损性增加，最终导致脑血管事件风险增加[20]，提示通过动态观察循环血白细胞变化、定量准确检测IPN来评估斑块的稳定性有利于降低脑血管事件。

本研究的不足：样本量较少；未分型比较LAAS斑块破裂和非破裂；未分析斑块内炎性活动与循环血白细胞及白细胞分类间关系。

综上所述，CEUS可评估颈动脉斑块的易损性，其定量参数与循环血白细胞和白细胞分类比例变化相关，有助于进一步认识斑块内炎性活动。循环血白细胞计数增加或中性粒细胞/淋巴细胞比增大可致斑块易损性增高。

[1] Li Z, Du L, Wang F, et al. Assessment of the arterial stiffness in patients with acute ischemic stroke using longitudinal elasticity modulus measurements obtained with shear wave elastography. Med Ultrason, 2016,18(2):182-189.

[2] Schinkel AF, Kaspar M, Staub D. Contrast-enhanced ultrasound: Clinical applications in patients with atherosclerosis. Int J Cardiovasc Imaging, 2016,32(1):35-48.

[3] Stenmark KR, Yeager M, EI Karim EC, et al. The adventitia: Essential regulator of vascular wall structure and function. Annu Rev Physiol, 2013,75:23-47.

[4] Li ZJ, Liu Y, Du LF, et al. Evaluating arterial stiffness in type 2 diabetes patients using ultrasonic radiofrequency. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci, 2016,36(3):442-448.

[5] 李朝军，孙昌琴，陆萍，等.实时剪切波技术评价急性缺血性脑卒中患者颈动脉纵向弹性模量.中国医学影像技术，2015，31(11)：1648-1652.

[6] Li Y, Zhu Y, Deng Y, et al. The therapeutic effect of bevacizumab on plaque neovascularization in a rabbit model of atherosclerosis during contrast-enhanced ultrasonography. Sci Rep, 2016,6:30417.

[7] Luengo-Fernandez R, Gray AM, Rothwell PM. A population-based study of hospital care costs during 5 years after transient ischemic attack and stroke. Stroke, 2012,43(12):3343-3351.

[8] Orekhov AN, Bobryshev YV, Sobenin IA, et al. Modified low density lipoprotein and lipoprotein-containing circulating immune complexes as diagnostic and prognostic biomarkers of atherosclerosis and type 1 diabetes macrovascular disease. Int J Mol Sci, 2014,15(7):12807-12841.

[9] Xu J, Lu X, Shi GP. Vasa vasorum in atherosclerosis and clinical significance. Int J Mol Sci, 2015,16(5):11574-11608.

[10] 孙杰，邓又斌，刘琨，等.超声造影定量评价动脉粥样硬化斑块新生血管及其与组织病理学的相关性.中国医学影像技术，2013,29(8)：1233-1236.

[11] Gjurich BN, Taghavie-Moghadam PL, Ley K, et al. L-selectin deficiency decreases aortic B1a and Breg subsets and promotes atherosclerosis. Thromb Haemost, 2014,112(4):803-811.

[12] Weiner SD, Ahmed HN, Jin Z, et al. Systemic inflammation and brachial artery endothelial function in the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis (MESA). Heart, 2014,100(11):862-866.

[13] Jaipersad AS, Shantsila A, Silverman S, et al. Evaluation of carotid plaque neovascularization using contrast ultrasound. Angiology, 2013,64(6):447-450.

[14] Wang SJ, Qu ZS, Zhang QD, et al. The serum levels of MMP-9, MMP-2 and vWF in patients with low doses of urokinase peritoneal dialysis decreased uremia complicated with cerebral infarction. Int J Clin Exp Med, 2015,8(8):13017-13027.

[15] 李振洲，任力杰，邵玉凤，等.CEUS颈动脉斑块灌注模式与短暂性脑缺血发作患者脑卒中发病的关系.中国医学影像技术，2017，33(4)：534-538.

[16] Saito K, Nagatsuka K, Ishibashi-Ueda H, et al. Contrast-enhanced ultrasound for the evaluation of neovascularization in atherosclerotic carotid artery plaques. Stroke, 2014,45(10):3073-3075.

[17] van den Oord SC, Akkus Z, Renaud G, et al. Assessment of carotid atherosclerosis, intraplaque neovascularization, and plaque ulceration using quantitative contrast-enhanced ultrasound in asymptomatic patients with diabetes mellitus. Eur Heart J Cardiovasc Imaging, 2014,15(11):1213-1218.

[18] Meijles DN, Pagano PJ. Nox and inflammation in the vascular adventitia. Hypertension, 2016,67(1):14-19.

[19] Majesky MW, Horita H, Ostriker A, et al. Differentiated smooth muscle cells generate a subpopulation of resident vascular progenitor cells in the adventitia regulated by Klf4. Circ Res, 2017,120(2):296-311.

[20] Fang H, Jiang W, Cheng J, et al. Balancing innate immunity and inflammatory state via modulation of neutrophil function: A novel strategy to fight sepsis. J Immunol Res, 2015,2015:187048.

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