茶叶中吡虫啉与啶虫脒农药残留速测技术研究

杨梅，罗逢建，陈宗懋，赵颖，朱国念*

1.中国农业科学院茶叶研究所，310008；2.浙江大学农药与环境毒理研究所，310058

近年来，茶叶质量安全问题越来越受到关注，其中水溶性农药吡虫啉和啶虫脒农药残留现象时有发生，特别是出口欧盟农残超标频遭通报。目前，有关茶叶中吡虫啉、啶虫脒残留的检测方法主要有液相[1-2]、气相[3-4]及超高效液相色谱－串联质谱法[5]等，虽然这些方法检测灵敏度和精确度都较高，但要使用大型色谱仪器，难以在基层普及，不利于大面积监控。用于现场快速筛查农药残留的方法主要是酶抑制法[6]，该方法主要用于检测有机磷及氨基甲酸酯类农药残留，受基质干扰大，检测假阳性比率偏高。近年来，基于抗原－抗体特异性反应研制出烟碱类农药的ELISA试剂盒[7-8]，但其检测方法需要多步反应，不易于现场操作。因此，吡虫啉和啶虫脒金标速测试纸条技术将有效满足市场监测、企业收购、自查时的快速检测需求，笔者就该速测技术对茶叶中吡虫啉与啶虫脒农药残留快速检测的效果进行了研究。

一、材料与方法

1.水溶性农药速测卡的检测原理

基于直接竞争免疫层析法原理的金标速测试纸条（图1），可用于快速检测茶叶中吡虫啉和啶虫脒的残留。人工抗原和二抗以条带状固定包被于硝酸纤维素膜上分别作为检测线（T线）和对照线（C线），胶体金标记的抗体吸附在结合垫上，待测物与固定在硝酸纤维素膜上的包被抗原竞争结合金标抗体。将样品溶液滴加到试纸条一端的样本垫上后，在玻璃纤维的毛细作用下向另一端移动，流经金标抗体结合垫溶解金标抗体并一同向上层析迁移，至T线时，固定在硝酸纤维素膜上的包被抗原与待测物一同竞争性地结合有限的金标抗体。之后未与固定在硝酸纤维素膜上的包被抗原结合的金标抗体继续向上层析至C线，被固定在硝酸纤维素膜上的二抗特异性结合滞留于对照线并显色。通过肉眼观察比较T线和C线颜色的深浅差异进行结果判定：待测物浓度低于检出限时，C线和T线两条颜色相近；当待测物浓度等于或高于检出限时，T线的颜色随之变浅；当待测物达到一定浓度时，待测物完全占据金标抗体上的结合位点，固定在硝酸纤维素膜上的包被抗原未竞争结合到金标抗体，此时T线不显色。C线均显红色条带，若C线红色条带消失，则试纸条检测失效。

图1 水溶性农药速测试纸条检测原理

2.试验方案

选取涵盖华南、江南、西南等我国主要产茶地区的茶叶进行水溶性农药速测卡应用效果调查，包括安徽、重庆、四川、贵州、江西、山东、云南、河南、浙江、湖北、广东、福建共计12个省（市）。在每个地区寄送的速测样品（表1）中随机抽样，用液质联用方法分析检测，与速测结果不一致的样品，将随后进行第2次速测分析，计算出吡虫啉、啶虫脒在不同检测范围中速测卡的准确率、假阳性以及假阴性概率。

表1 各地区茶叶样品数量

（1）速测卡测定步骤

鲜叶：称取2g样品，用研钵研磨后按1∶10（即1g样品，10mL开水）加入20mL开水，混匀静置10～15min至室温。

干茶：称取2g样品，按1∶30（即1g样品，30mL开水）加入60mL开水冲泡，混匀静置10～15min至室温。

用塑料滴管在平放的速测卡的两个加样孔中各滴入2滴提取液，10～15min内观察结果判断有效（图2）。

图2 速测卡显色示意图（欧盟标准0.05mg/kg,国家标准GB2763暂按0.50mg/kg）

（2）速测卡结果判定

由图2可知，阴性（－）结果为T线（检测线，靠近加样孔端）与C线颜色显色接近，表明样品中吡虫啉、啶虫脒含量均低于0.05mg/kg。阳性（＋）结果为T线比C线颜色明显变浅或无显色，表明样品中吡虫啉、啶虫脒含量均高于0.05 mg/kg。无效为C线未显色，可能是操作不当或检测卡已失效。

（3）检测效果验证

样品加标试验：称取干茶（绿茶）、鲜叶（龙井43）空白样品各2g进行加标实验，干茶样品中加入吡虫啉和啶虫脒混标，添加水平分别为0、0.05、0.20、0.50mg/kg；鲜叶样品中加入混标，添加水平为0、0.05、0.10mg/kg，按照上述操作进行检测。

仪器检测对比：按照食品安全国家标准《茶叶中448种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱－质谱法》（GB23200.13—2016）对茶叶中吡虫啉、啶虫脒残留进行测定。速测卡结果与仪器分析结果比对，若仪器测定值在速测卡测定的范围值内（＜0.05mg/kg，0.05～0.50mg/kg，＞0.50mg/kg），认为速测卡测定准确，反之，速测卡测定不准确。计算公式：速测卡准确率=速测准确样本数/实际有效样本数×100%。

二、结果与分析

1.速测卡的检测灵敏度

分别配制含有0、1、5、10μg/kg吡虫啉、啶虫脒单标的各基质（绿茶、红茶、鲜叶与水）溶液，按照检测卡操作说明进行检测，结果表明当各基质中吡虫啉、啶虫脒含量达到5μg/kg时，能使T线消失，即吡虫啉、啶虫脒在茶汤中的检测限均为5μg/kg。

2.样品加标试验结果

样品中的农药浓度与T线颜色显色呈负相关。当干茶样品中吡虫啉和啶虫脒的添加水平均为0.50mg/kg时，T线完全消失；随着样品浓度的降低，T线显色越来越明显，当样品中吡虫啉、啶虫脒含量低于0.05mg/kg时，T线与C线颜色显色接近（图3）；同样，鲜叶中吡虫啉、啶虫脒含量为0.05mg/kg时，T线显色较浅，而随着样品添加水平增加至0.10mg/kg时，T线几乎不显色（图4）。

3.速测卡的准确性

抽检绿茶、红茶、鲜叶及其他（茉莉花、黑茶、白茶、乌龙茶和茶粉）类型茶共计154个样品，其中有效样品数量为145个（9个样品速测结果失效，后续准确率计算时这些失效样品均未统计），速测结果与仪器检测结果比对，吡虫啉和啶虫脒的半定量速测准确率分别达到91.5%和90.5%，假阳性概率分别为1.4%和2.4%，假阴性概率分别为3.5%和3.2%（表2）。可见水溶性速测卡检测吡虫啉、啶虫脒的结果是较为可靠的，可专门用于检测茶叶的吡虫啉、啶虫脒农药残留。

图3 干茶中农药添加测定结果

图4 鲜叶中农药添加测定结果

三、讨论

新烟碱杀虫剂对蜜蜂等传粉昆虫具有潜在的毒性与危害，迫使欧盟等多个国家开始重新评估此类杀虫剂对环境的毒性与危害。早期，因新烟碱类农药对茶叶上的小绿叶蝉具有较好的防治效果，在我国茶园大面积使用；但吡虫啉和啶虫脒在茶汤中浸出率较高，存在饮茶安全隐患。为了更好地控制茶叶质量安全，2009年，国家茶产业技术体系专家提出水溶性农药替代计划，吡虫啉、啶虫脒农药的限制（不推荐）在茶叶上使用。因此，迫切需要一种能够现场快速检测茶叶中吡虫啉、啶虫脒残留的产品，监督并规范农户科学用药。

由于吡虫啉、啶虫脒试纸条与其他烟碱类农药无明显的交叉反应[9]，而茶叶本身内含物质丰富，更容易引起速测结果的假阳性或假阴性。为了确保试验结果的可靠性，可适当增加样本的稀释倍数，即增加提取溶剂水的比例。试纸条的检出限（0.05mg/kg）与本研究中的液质联用仪器的检出限（0.05mg/kg）一致，但两者的样品前处理方法不同，后者需通过提取、浓缩和净化等多步处理才能得到待测样品，而前者只需提取和稀释即可得到待测样品，因此试纸条方法具有方便快捷的优势。速测卡可适用于鲜叶、干茶（红茶、绿茶、乌龙茶、花茶等）样品的半定量测定，测定范围：0.05～0.50mg/kg。目前，茶叶中吡虫啉和啶虫脒在国内最大残留限量分别为0.50mg/kg和10mg/kg[10]，欧盟的限量标准均为0.05mg/kg[11]。该测定范围能够满足欧盟和中国对茶叶中的吡虫啉、啶虫脒的最大残留限量的的不同检测要求。

表2 茶叶中吡虫啉与啶虫脒农药残留速测结果

因此，水溶性农药速测卡具有检测时间短（10～15min）、灵敏度高（检出限为0.05mg/kg）、操作简单、成本低，对操作员技术水平要求低，在简易实验室甚至室外就能进行现场检测等优点，也可为企业收购茶农或其他来源的茶叶（鲜叶和干茶）、拼配、出口，以及市场抽查等情况下，吡虫啉和啶虫脒的农残检测提供有效的初筛工具。

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[11]European Commission .Current MRL values: Pesticide residues and maximum residue levels [EB/OL].(2017-11-27).http://ec.europa.eu/food/plant/pesticides/eu-pesticides-database/public/?event=homepage&language=EN.