运动训练诱导大鼠心肌HGF和TGF-β1表达对心肌细胞增殖的影响

邢维新 田振军

摘 要： 目的：探討运动训练诱导大鼠心肌HGF和TGF-β1表达及其对心肌细胞增殖的影响。方法：30只3月龄SD雄性大鼠随机分为安静对照组、有氧运动组和大强度运动组，每组10只。安静对照组大鼠不运动，有氧运动以15 m/min开始，递增速度为3 m/min、时间为5 min，运动至速度20 m/min，增加跑台坡度为5%，运动总时间为60 min，每周训练5天。大强度运动以15 m/min开始，递增速度为3 m/min、时间为10 min，运动至速度35 m/min，增加跑台坡度为10%，运动总时间为90 min，每周训练6天，各组训练时间均为8周。训练结束后进行HE染色观察、血流动力学和心电图测定，免疫组化和免疫荧光检测大鼠心肌PCNA、Ki-67、HGF和TGF-β1的表达。结果：与安静对照组相比，有氧训练组大鼠心系数、LVSP、±dp /dtmax和T波电压均有显著性升高（P<0.05），LVEDP和心率均显著下降（P<0.05），双核细胞出现率增加，心肌组织中Ki-67、PCNA 、HGF和TGF-β1的MOD值均显著升高（P<0.05），Ki-67和PCNA阳性细胞数量增多;大强度训练组大鼠心系数、心率、LVED和PQT间期均显著性升高（P<0.05），LVSP和±dp /dtmax均显著下降（P<0.05），心肌组织中Ki-67和PCNA和HGF的MOD值下降，其中HGF的下降显著（P<0.05），TGF-β1的MOD值则显著升高（P<0.01）。结论：有氧运动大鼠心肌组织Ki-67和PCNA的表达升高，Ki-67和PCNA阳性细胞数量增多，心肌细胞增殖，有氧运动上调HGF和TGF-β1的表达可能促进心肌细胞增殖的发生;大强度运动可使心肌组织中Ki-67和PCNA的表达降低，心肌细胞增殖抑制;心肌细胞增殖可能是有氧运动提高心脏功能的一个重要机制。

关键词： 运动训练;大鼠;心功能;心肌细胞增殖

中图分类号：G804.2   文献标识码：A  文章编号：1006-2076（2018）06-0084-07

Abstract： Objective：To explore the effect of exercise training on the expression of HGF and TGF-β1 and its effect on the cardiomyocytes proliferation in rats. Methods：30 rats at the age of SD 3 months were divided into 3 groups in random way as normal control group， aerobic sports group and high-intensity training group， with 10 rats each group. Rats in normal control group did not exercise，

The rats in aerobic sports group do exercise at the speed of 15m/min， and then add speed at the rate of 3m/min for 5min， when the speed is 20m/min，5% of the running platform Gradient will be increased，After the rats in aerobic sports group do exercise for Total 60min， and they do training for 5 days per week;The rats in in high-intensity training group do exercise at the speed of 15m/min， and then add speed at the rate of 3m/min for 10 min， when the speed is 35m/min，10% of the running platform Gradient will be increased，After the rats in aerobic sports group do exercise for Total 90min， and they do training for 6 days per week;After the training for each group HE dyeing observation and determination of cardiac function by Hemodynamic and electrocardiogram， the expressions of PCNA， Ki-67， HGF， TGF-β1 in the myocardial tissue of rats have been checked by the way of immunohistochemistry and immunofluorescence. Results：Compared with normal control group， the heart coefficient， LVSP， ±dp/dtmax and T wave voltage of the rats from aerobic sports group have increased dramatically （P<0.05）， while both LVEDP and HR decreased greatly （P<0.05）; There is an increase of occurrence rate of binucleated cell， and MOD of Ki-67， PCNA， HGF and TGB-β1 in the myocardial tissue of rats was rising dramatically （P<0.05）; the number of Ki-67 and PCNA positive cells increased; Meanwhile， the heart coefficient， LVEDP and PQT interphase of the rats in high-intensity group rose dramatically （P<0.05） while their LVSP and ±dp /dtmax decreased greatly （P<0.05）， The MOD of Ki-67， PCNA， HGF decreased in high-intensity group rats， with HGF dropping greatly （P<0.05）; But the MOD of TGB-β1 rose dramatically （P<0.05）. Conclusions：The expression of Ki-67 and PCNA increased， the proliferation of myocardial cell improved， and the number of Ki-67 and PCNA positive cells increased in myocardial tissue of the rats of aerobic exercise group. The increase of HGF and TGB-β1 induced by aerobic exercise may promote the occurrence of the cardiomyocytes proliferation. While the high-intensity exercise can decrease the expression of Ki-67 and PCNA， and inhibit the proliferation of myocardial cell. Myocardial proliferation may be an important mechanism for aerobic exercise to improve heart function.

Key words： exercise training; rats; cardiac function; cardiomyocyte proliferation

传统观点认为，成熟的心肌细胞不能进行分裂，没有增殖能力。然而，心肌细胞可发生凋亡已成为一个不争的事实，从维护心脏完整的角度推测心肌中必然存在着细胞增殖。2000年以来，随着科学研究方法的进步和研究技术的改进，心肌细胞具有分裂增殖能力的证据越来越多。Kajstura等研究发现，从出生到衰老，大鼠心脏中有相当比例的心肌细胞不断在进行着分裂，以补充由于老化而引起的哺乳动物心肌细胞的不断死亡[1]。随后诸多学者证实在人、大鼠和小鼠的心脏中均存在着细胞的增殖[2-7]，心肌细胞增殖可作为心脏损伤后修复再生的基础[5，8]。

近年来，有关运动与心肌细胞增殖的相关研究引起了国内外广大学者的关注，相继已有文献报道。Waring CD等应用Western Blotting研究表明，有氧运动可使成人心脏心肌细胞Ki-67和Brdu表达显著提高[9]。田振军等应用Western Blotting研究表明，有氧运动可使大鼠心肌细胞PCNA的表达显著升高[10]。肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor， HGF）是一种多功能的细胞因子，可促进细胞增殖、迁移和形态发生[11]，对心梗心肌细胞增殖具有促进作用[12-13]。转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）可参与细胞的增殖、分化、迁移和凋亡等[14]，TGF-β1的高表达可刺激胚胎的心肌细胞分化[9]。目前，运动训练对心肌HGF、TGF-β1表达的影响及其在心肌细胞增殖中的作用尚缺乏全面的文献报道。本文采用免疫组织化学与免疫荧光等研究方法探讨运动训练对心肌细胞增殖因子PCNA、Ki-67及细胞生长因子HGF、TGF-β1表达的影响，并探讨HGF、TGF-β1在心肌细胞增殖中的作用，为运动性心脏肥大的机制研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 体重180～220 g的Sprague Dawley 3月龄雄性大鼠30只，购于西安交通大学医学院实验动物管理中心。1周适应性喂养后，随机分为安静对照组、有氧运动组和大强度运动组，每组10只，均按啮齿类动物干燥饲料喂养，自由饮水、进食，分每笼5只饲养。大鼠在饲养和训练过程中，安静对照组存活10只，有氧运动组死亡1只，大强度运动组大鼠死亡2只。

1.2 大鼠运动训练方案 安静对照组大鼠不运动，正常笼内生活。有氧运动组和大强度运动组的运动负荷参照Bedford标准并略加改动[15]。有氧运动以15 m/min开始，递增速度为3 m/min、时间为5 min，运动至速度20 m/min，增加跑台坡度为5%，运动总时间为60 min，每周训练5天。大强度运动以15 m/min开始，递增速度为3 m/min、时间为10 min，运动至速度35 m/min，增加跑台坡度为10%，运动总时间为90 min，每周训练6天，各组训练时间均为8周。大鼠训练过程中用小于1 mV的电刺激强迫进行。

1.3 心电图与血流动力学指标测定 8周训练结束后，次日早晨大鼠腹腔麻醉，心电图检测，主要指标有HR、QRS波群间期、QT间期、T波电压等参数。RM-6240多导生理记录仪测量左心室收缩压（LVSP）、左心室舒张末压（LVEDP）、左心室内压最大上升速率（+dp/dtmax） 和左心室内压最大下降速率（-dp/dtmax）等血流动力学参数。

1.4 取材与样品制备 大鼠心电图和血流动力学测定结束后，迅速取出心脏，生理盐水冲洗，滤纸吸干称重，10%的中性甲醛溶液固定。常规酒精梯度脱水、二甲苯透明、浸蜡和石蜡包埋，以5 μm厚度连续切片用于HE染色、免疫组织化学和免疫荧光实验样品。

1.5 免疫组织化学与免疫荧光实验 免疫组织化学实验方案：采用SABC法，严格按试剂盒说明书操作步骤进行。取2套切片用去离子水冲洗，3%H2O2封闭。抗原修复：Ki-67、PCNA、HGF和TGF-β1微波修复，PBS冲洗;滴加正常山羊血清20min。滴加一抗： Ki-67、PCNA、HGF和TGF-β1抗体浓度为1[KG-*3]∶[KG-*3]70，4℃过夜，PBS冲洗;滴加二抗37℃ 20 min，PBS冲洗;滴加SABC 20 min，Tween+PBS混合液冲洗2 h;DAB显色，蒸馏水冲洗;中性树胶封片。染色设置阴性对照，即PBS代替一抗，其他程序同上。

免疫荧光实验方案：连续切片严格按试剂盒说明书操作步骤进行，切片常规脱蜡至水。抗原修复：Ki-67、PCNA微波修复20 min，PBS冲洗;正常山羊血清封闭，37℃，45 min。滴加一抗：Ki-67、PCNA、α-肌动蛋白抗体浓度为1[KG-*3]∶[KG-*3]200，4 ℃过夜，Tween+PBS混合液冲洗沖洗30 min，PBS洗3次，每次10 min。滴加二抗（避光）：抗体浓度比为1[KG-*3]∶[KG-*3]50，4 ℃，24 h，Tween+PBS混合液冲洗冲洗30 min，PBS洗10 min×3次（免疫荧光双标再滴加一抗和二抗，步骤同上），甘油磷酸缓冲液封片。染色设置阳性对照、阴性对照和自发荧光对照，分别用阳性血清、正常血清和PBS代替一抗。

1.6 数据处理与分析 免疫组织化学实验结果用Olympus光学显微镜高、低倍结合观察拍照，再用Image-Pro Plus6.0软件采集数据，计算平均光密度值（MOD）。运用SPSS18.0 for Windows软件包进行统计学处理，统计学方法采用One-Way ANOVA，结果以均数±标准差（[AKX-]±SD）表示。显著性差异选择P<0.05和P<0.01水平。免疫荧光化学图像采用高、低倍结合，整体采集，局部放大，Leica TCS SP5激光共聚焦扫描显微镜拍片。

2 实验结果

2.1 大鼠体重、心脏重量及心系数的变化

实验结果显示，与安静对照组相比，有氧运动组大鼠体重显著降低（P<0.05）、心脏重量明显增加（P<0.01）、心系数显著升高（P<0.05）;大强度运动组大鼠体重显著下降（P<0.01）、心脏重量明显增加（P<0.05）、心系数显著升高（P<0.05），综上所述，有氧训练和大强度运动均可使大鼠心脏发生肥大（见表1）。

2.2 大鼠血流动力学指标和心电图的变化

2.2.1 大鼠血流动力学指标的变化

实验结果显示， 与安静对照组相比，有氧训练组大鼠LVSP和±dp /dtmax均有显著性升高（P<0.05），LVEDP显著下降（P<0.05），表明有氧运动可显著提高大鼠心脏的功能;大强度训练组大鼠LVSP和±dp /dtmax均显著下降（P<0.05）， LVEDP则显著性升高（P<0.05），表明大强度运动可使大鼠心脏功能下降（见表2）。

2.2.2 大鼠心电图的变化

实验结果显示，与安静对照组相比，有氧训练大鼠心率显著下降，T波电压显著升高（P<0.05），QRS波群间期和QT间期无显著变化，表明心脏功能增强;疲劳运动大鼠心率和QT间期显著提高（P<0.05），QRS波群间期和T波电压无显著变化，表明心肌收缩时间延长，心功能下降（见表3）。

2.3 HE染色观察结果

HE染色结果显示，安静对照组大鼠心肌细胞排列紧密整齐，胞浆呈红色，细胞核呈蓝色，区分明显，偶见双核心肌细胞出现;有氧运动大鼠心肌纤维结构清晰，肌纤维和细胞核大小匀称，排列较安静对照大鼠更紧密整齐，染色均匀，双核细胞出现率高于对照组;大强度运动组大鼠心肌细胞肥大、混浊肿胀，肌纤维间隙增大，心肌纤维排列较有氧运动和安静对照大鼠松散紊乱，细胞间界限模糊，有部分肌纤维断裂，并在心肌细胞周围可见大量红细胞，双核细胞出现率与安静对照组差异不明显（见图1）。

2.4 大鼠心肌组织Ki-67、PCNA、 HGF和TGF-β1的免疫组化结果

在光学显微镜下可见，Ki-67、PCNA、 HGF和TGF-β1在各组大鼠心肌中均有表达，Ki-67、PCNA和HGF在心肌细胞中的表达见于细胞核中，TGF-β1主要表达于心肌细胞浆。与安静对照组相比，有氧运动可使大鼠心肌组织中Ki-67、PCNA 、HGF和TGF-β1的MOD值均显著升高（P<0.05），分别升高了18.8%、22.2%、10.8%和13.0%。大强度运动则使大鼠心肌组织中Ki-67和PCNA和HGF的MOD值下降，其中HGF的下降显著（P<0.05），分别下降了6.3%、5.6%、10.8%，TGF-β1的MOD值显著升高，升高了34.8%（P<0.01（见表4和图2）。

2.5 大鼠心肌组织Ki-67、PCNA的免疫荧光结果

激光共聚焦扫描显微镜下，α-actinin标记为红色，Ki-67标记为绿色，淡黄色表示心肌细胞核中Ki-67表达。在正常心肌组织中，淡黄色或黄绿色细胞很少，偶见心肌细胞核有表达，表明Ki-67阳性细胞数量很少;与安静对照组比较，有氧运动组大鼠心肌细胞淡黄色或黄绿色明显增多，表明有氧运动可使大鼠心肌Ki-67阳性细胞数量明显增多;大强度运动组大鼠淡黄色或黄绿色很少，偶见心肌细胞核有表达，Ki-67阳性细胞数量变化不显著。α-actinin标记为绿色，亮绿色标记PCNA。正常心肌组织中，心肌细胞核偶有亮绿色出现，表明正常心肌组织中PCNA阳性细胞数量很少;有氧运动大鼠亮绿色明显增多，且主要在心肌细胞核上，表明有氧运动可使大鼠心肌PCNA阳性细胞数量明显增多;疲勞运动大鼠亮绿色出现与安静对照组差异不明显，PCNA阳性细胞数量变化不显著（见图3）。

3 分析与讨论

3.1 运动训练可对大鼠心肌组织结构和心功能产生影响

业已证实，有氧运动可使心脏的形态结构产生良性影响，提升心脏的功能，大强度运动则产生相反的结果。本研究通过HE染色、血流动力学指标及心电图测试结果表明，有氧运动可使大鼠心肌纤维排列较安静对照组大鼠更紧密整齐，染色均匀，双核细胞出现率高于安静对照组，同时心系数、LVSP和±dp /dtmax及 T波电压均显著性升高，LVEDP和HR均显著下降，表明有氧运动使大鼠心脏结构产生良性影响，心肌细胞产生适应性肥大，心率减慢，心输出量增加，心功能显著提高;大强度运动使大鼠心肌纤维排列较有氧运动和安静对照大鼠松散紊乱，细胞间界限模糊，有部分肌纤维断裂，心系数、LVEDP和QT间期均显著性升高，LVSP和±dp /dtmax均显著下降，表明大强度运动使大鼠心脏形态结构产生不良影响，心率加快，心肌收缩时间延长，传导延迟或阻滞，心功能降低。

3.2 运动训练可对大鼠心肌细胞双核出现率产生影响

1996年Olivetti G等研究表明，人的心肌细胞有的是单核，有的是双核，一般单核约占74%，双核约占25.5%，这一比例不随年龄、心脏肥大和缺血性心肌病而改变[16]。Bergmann和Kajstura等研究则认为，人在生长过程中，心肌细胞会缓慢更新，且随年龄下降[5，17]。另有文献报道，山羊出生后超过50%的心肌细胞进行着胞核分裂，随着生长发育，单核细胞总数开始下降，双核细胞数量迅速增加[18]。本研究表明，与安静对照组相比，有氧训练组大鼠双核细胞出现率增加，表明有氧运动可使大鼠心肌细胞增殖的细胞核分裂显著增加。大强度运动组大鼠则没有差异。

3.3 运动训练可对大鼠心肌组织PCNA和Ki-67表达产生影响

近年来，心肌细胞增殖研究成为了基础医学、生命科学和体育科学研究领域的一个重大热点问题，研究内容主要集中在不同状态下心肌细胞增殖因子（PCNA、Ki-67和Brdu等）的表达。

Ki-67抗原是存在于增殖细胞核的一种非组蛋白性核对蛋白，由345kd和395kd的两条多肽链组成，与细胞增殖关系密切。研究认为，Ki-67可评估细胞的增生程度，是目前较为肯定的核增殖标志基因[19]。PCNA是DNA 复制合成过程中的一种必需的物质，并在DNA的修复过程中发挥重要作用。检测PCNA是心肌细胞分裂增殖研究中一个常用的方法[20]。1998年以来，心肌细胞的增殖研究引起了国内外学者的高度重视。Beltrami 等用心肌肌动蛋白抗体显示心肌细胞，Ki-67作为细胞增殖的标志，在心肌梗死边缘区和远距离区每百万个心肌细胞分别检出800个及300个Ki-67 阳性细胞[21]。Quaini 等在研究中发现，心肌梗死患者左心室心肌细胞PCNA 阳性率高达49%±19%，而其他相关报道多在10%以下[22]。综上可见，有关心肌细胞增殖的研究一直以来主要集中在心肌梗死的心脏。

近年来，运动与心肌细胞增殖研究亦成为了体育科学、生命科学与基础医学等研究领域的一个重大课题，引起了国内外相关专家学者的关注。目前，有关运动促进心肌细胞增殖因子表达的研究已有文献报道。Waring等研究表明，与安静组相比，4周跑台运动训练可使大鼠左心室表达Brdu、ki-67 的心肌细胞增加，增加的百分比分别为7.2±1.3%和1.9±0.7%[23]。田振军等学者运用Western Blotting证实，有氧运动可使大鼠心肌细胞PCNA的表达显著升高[10]。本研究免疫组织化学结果表明， 与安静对照组相比，有氧运动大鼠心肌组织Ki-67、PCNA分别升高了18.8%、22.2%，提示有氧运动可使大鼠心肌组织Ki-67、PCNA的表达显著升高。大强度运动则可使大鼠心肌组织中Ki-67和PCNA的表达分别下降了6.3%、5.6%，差异不显著。免疫荧光结果显示，在正常心肌组织中，Ki-67、PCNA阳性细胞数量很少;有氧运动可使Ki-67、PCNA阳性细胞数量明显增多;大强度运动组大鼠Ki-67、PCNA阳性细胞数量变化不显著。综上可见，有氧运动可促进大鼠心肌细胞增殖，大强度运动则抑制大鼠心肌细胞的增殖。

3.4 运动训练诱导大鼠心肌HGF 和TGF-β1表达影响心肌细胞增殖

近年来，心肌细胞增殖及其诱导因素的相关研究引起了众多专家学者的关注。目前认为，HGF和TGF-β1等多种细胞生长因子参与了心肌细胞增殖的过程。HGF是由一条含有728个氨基酸的单链前体蛋白裂解而来的异质二聚体。研究发现，HGF 是一种多功能的细胞因子，它具有促细胞增殖、迁移和形态发生，在胚胎生长、组织形成和组织器官修复中起重要作用[11]。TGF-β是一组对细胞生长、分化等起调节作用的细胞因子超家族，有三种亚型即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。研究发现，TGF-β1可参与细胞增殖、分化、抑制炎症、促进血管新生、引起心肌细胞肥大、纤维化 [14]。

目前，有关运动对心肌细胞生长因子HGF和TGF-β1表达的影响及其在心肌细胞增殖中的作用研究文献报道尚缺。本研究结果显示，有氧运动可使大鼠心肌组织中HGF和TGF-β1的表达显著升高，大强度运动则可使大鼠心肌组织中HGF的表达显著降低，TGF-β1的表达过度升高。前文报道，有氧运动可以使心肌组织中PCNA、Ki-67的表达显著升高，Ki-67、PCNA阳性细胞数量明显增多，心肌细胞趋于增殖，而大强度运动则可使心肌组织中PCNA、Ki-67的表达下降，心肌细胞增殖抑制。研究表明，HGF可通过p27途径促进心肌梗死后心肌细胞增殖，其下游途径与心肌细胞周期蛋白CyclinA/cdk2、CyclinE/cdk2和CyclinD1/cdk4有关[13]。因此推测，有氧运动上调HGF的表達促进心肌细胞增殖，其机制可能为HGF通过p27途径，与下游CyclinA、CyclinE、CyclinD1与cdk4等细胞周期蛋白的表达有关;大强度运动使HGF的表达降低则可能抑制了心肌细胞增殖的发生。TGF-β1对细胞的增殖作用可表现出促进或抑制作用，一般认为，低浓度的TGF- β1促进细胞增生，而高浓度时则抑制细胞增生。陈章炜等研究表明，新生大鼠心肌细胞的增殖可能与TGF-β1表达增高有关[24]。另有研究表明，TGF-β1的高表达可刺激胚胎的心肌细胞分化[9]。由此推测，TGF-β1参与了大鼠心肌细胞的增殖，有氧运动使TGF-β1表达升高可能促进心肌细胞增殖的发生;大强度运动诱导TGF-β1的过度表达则会抑制心肌细胞的增殖。近年来，有关心肌细胞增殖的细胞信号转导通路已有相关文献报道。Bersell K等研究表明，心肌细胞能够被NRG1/ErbB4信号诱导激活，发生心肌细胞增殖，促进心肌再生和提升心功能[25]。另有研究表明，运动训练调节NRG1表达并激活ErbB2和ErbB4 PI3K/Akt信号转导通路，通过促进内源性心肌再生修复心脏[26]。有氧运动上调HGF和TGF-β1表达促进心肌细胞增殖的细胞信号转导通路研究仍有待于今后深入研究。

本研究表明，有氧运动可使大鼠心肌产生适应性肥大，心肌细胞增殖，TGF-β1参与了肥大和增殖过程。Bei Y等研究表明，运动诱发心脏生理性生长中心肌细胞增殖是不必要的，但运动在保护缺血再灌注损伤中是必需的[27]，因此，运动性心肌肥大是否有心肌细胞增殖产生的心肌细胞有待今后实验证实。大强度运动可使大鼠心脏肥大，[JP+1]心肌细胞增殖抑制，表明大强度训练引起的心脏肥大主要以细胞体积增大为主。

4 结论

有氧运动大鼠心肌组织Ki-67和PCNA的表达升高，Ki-67和PCNA阳性细胞数量增多，心肌细胞增殖，有氧运动上调HGF和TGF-β1的表达可能促进心肌细胞增殖的发生;大强度运动可使心肌组织中Ki-67和PCNA的表达降低，心肌细胞增殖抑制;心肌细胞增殖可能是有氧运动提高心脏功能的一个重要机制。

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