一例输入型H6N1亚型禽流感的检测分析

王 艳，李金平，张磊萍，程善菊，张 强，李春阳，侯广宇，彭 程，蒋文明

（1.上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心，上海 200135；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

禽流感（Avian influenza，AI）是由禽流感病毒（AIV）感染多种禽类引起的一种急性高度接触性传染病[1]。跟据病毒囊膜表面血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的不同，A型流感病毒又可分为不同亚型。目前鉴定的16种HA亚型和9种NA亚型均可从野禽（尤其是野水禽）中分离到。根据AIV对鸡和火鸡的致病性不同，AI可分为高致病性和低致病性。高致病性AIV主要包括H5或H7亚型的某些毒株。一些亚型的毒株，如H7N9（低致病性）、H10N8、H9N2、H6N1等，虽然对家禽是低致病性的，但是可以感染人类，具有重要的公共卫生意义。AI不但给养禽业造成了严重的经济损失，还严重威胁着公众健康，也影响多边贸易往来，因而备受社会广泛关注。

2017年10月12日，上海机场检验检疫局旅检处现场截获一批来自台湾地区的冻鸡。根据疫情监测需要，对其进行了AI相关项目检测。为了更深入了解其携带病毒的生物学特性，对病原进行了分离鉴定，以及序列和致病性分析。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

QIAamp Viral RNA Mini Kit：购自Qiagen公司；HiScript II One Step RT-PCR Kit：购自Vazyme公司；DNA胶回收试剂盒：购自Takara公司；A型禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒（批号20170502）、禽流感病毒H5亚型荧光RT-PCR检测试剂盒（批号20170502）、禽流感病毒H7亚型荧光RT-PCR检测试剂盒（批号20170902）、禽流感病毒H9亚型荧光RT-PCR检测试剂盒（批号20170402）：购自凯杰生物工程有限公司；Balb/c小鼠：购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 病毒RNA提取

采集冻鸡的肝脏、肺脏组织，将其剪碎后加入适量PBS，用组织匀浆机进行研磨匀浆；-20 ℃冻融1次后，10 000 r/min离心10 min；提取组织上清中的病毒RNA，-80 ℃保存备用。

1.3 荧光RT-PCR检测

使用荧光RT-PCR试剂盒，先对样品进行A型AIV核酸检测，然后分别进行H5、H7、H9亚型AIV核酸检测。检测仪器为Applied Biosystems ViiA 7。

1.4 病毒分离

将组织上清用0.22 μm滤器过滤后接种10日龄SPF鸡胚，35 ℃孵化3 d；收取尿囊液，用1%的鸡红细胞测定血凝效价。

1.5 病毒全基因组扩增

提取尿囊液中的病毒RNA，根据Hoffmann发表的引物进行RT-PCR反应[2]。反应体系：模板RNA 3.0 μL、RT-PCR Buffer 12.5 μL、引物（10 μmol/L）1.0 μL、Enzyme Mix 1.25 μL、ddH2O 6.25 μL。RT-PCR反应程序：50 ℃反转录30 min，94 ℃预变性2 min，然后94 ℃变性30 s，57℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，进行35个循环，最后72 ℃延伸5 min。将PCR产物经DNA胶回收试剂盒纯化回收后，送青岛志远进行测序。

1.6 序列分析

对测得的基因组序列进行BLAST和相关生物信息学分析。

1.7 SPF鸡致病性试验

根据世界卫生组织（WHO）动物流感操作手册，将病毒用PBS稀释10倍后，接种10只6周龄SPF鸡，0.1 mL/只；每天观察和记录发病和死亡情况，连续观察10 d，计算静脉致病指数（Intravenous pathogenicity index，IVPI）。

1.8 小鼠致病性试验

为了测定病毒对哺乳动物的感染性和致病力，将病毒做10倍比稀释；将每个稀释度病毒经鼻腔接种5只6周龄BALB/c小鼠，50 μL /只；每天观察小鼠的发病情况并称量体重，直至14 d结束。

使用106EID50的病毒感染小鼠，3 d后采集肺、鼻窦、肝、脾和脑等组织进行病毒滴定。

2 结果

2.1 荧光RT-PCR

样品RNA经荧光定量RT-PCR检测显示为A型AIV核酸阳性（图1-A），H5、H7、H9亚型AIV核酸为阴性（图1-B、图1-C、图1-D）。

2.2 病毒分离与基因组测序

病料处理后接种10日龄SPF鸡胚，3 d 后收集鸡胚尿囊液，血凝效价为28～29。分离毒命名为A/chicken/Taiwan/6634/2017，缩写为TW6634。对TW6634病毒进行全基因组扩增和测序。将HA和NA序列进行BLAST比对，发现TW6634病毒血清型为H6N1亚型。

2.3 序列分析

图1 样品的荧光定量RT-PCR检测

基因组序列BLAST分析表明，TW6634内部基因与台湾本地流行的H6N1和H5N2亚型AIV同源性最高，说明该H6N1病毒可能是由H5N2和H6N1亚型病毒重组而来的。TW6634的HA和NA与台湾A/chicken/Taiwan/2437/2012（H6N1）和A/chicken/Taiwan/2084/2012（H6N1）同源性分别为96.71%和97.88%，说明毒株为台湾源，与食品来源地一致（表1）。

表1 A/chicken/Taiwan/6634/2017（H6N1）基因组与GenBank中流感病毒同源性比较

对TW6634病毒基因组进行生物信息学分析，发现TW6634病毒HA受体结合位点为P186、V190、Q226和S228，表明TW6634倾向于结合人样α2,6-唾液酸受体[2-3]。NS1基因在149位点有A的突变，提示该病毒可能会提高对鸡体的致病力[4]；M2基因在31位有N的突变，提示可能对金刚烷胺有耐药性[5]。

2.4 对鸡的致病性

TW6634病毒静脉接种SPF鸡后，10 d内10只鸡全部存活，没有表现任何临床发病症状，IVPI为0（表2），因此TW6634为低致病性病毒。

表2 TW6634病毒对鸡和小鼠的致病性

2.5 对小鼠的致病性

将TW6634病毒接种小鼠后，接毒小鼠均未表现出临床症状和死亡。体重监测表明，只有高剂量感染组（10-1和10-2病毒稀释组）出现轻微的一过性体重减轻（图2）。感染后3 d，处死4只感染小鼠，采集其肺、鼻窦、脾和脑组织，进行病毒分离滴定，仅在感染小鼠的肺脏中分离到病毒，滴度为103.7EID50/g（表2）。

图2 不剂量感染组小鼠的体重变化

3 讨论

2013年6月21日台湾地区发现全球首例人H6N1禽流感感染病例，并证实从患者分离的病毒基因序列与台湾本土家禽H6N1病毒株最为接近。

H6N1病毒为家禽和野鸟中普遍存在的低致病性AIV。近年来，我国H6亚型AIV分离率越来越高[6-8]，尤其是在水禽中。这可能与水禽中的H6亚型AIV对家禽的适应能力逐渐增强有关[6-7]。受体结合试验表明，超过1/3的H6亚型病毒可以识别人样受体[8]。动物试验表明，某些H6亚型病毒可以在小鼠体内有效复制，并能通过接触传播[8]。而且，有研究表明，只需将HA裂解位点处的序列突变为高致病性AIV特征序列，H6病毒可突变为高致病性病毒。所以，H6亚型禽流感病毒对人类和家禽都是一个潜在威胁，应引起重视。

4 结论

检测证实，从本批截获的台湾冻鸡中检测出了H6N1亚型AIV（TW6634）。该毒株对鸡是低致病性的（IVPI为0）。这与其HA裂解位点处的氨基酸序列（PQIATR/G）一致。序列BLAST分析表明，TW6634与台湾当地流行的H6N1病毒同源性最高，亲缘关系最近。HA受体结合位点分析表明，TW6634倾向于结合人样2,6-唾液酸受体，可在小鼠肺脏中复制。虽然该病毒目前致病力较弱，高剂量感染仅能引起小鼠轻微的一过性体重减轻，但有突变为高致病性病毒的风险，对人类和家禽存在潜在威胁，因此不容忽视。

[1] 蒋文明，刘朔，陈继明. 当前我国禽流感流行情况分析[J]. 中国动物检疫，2015，32（1）：60-63.

[2] WANG F，QI J，BI Y，et al. Adaptation of avian influenza A（H6N1）virus from avian to human receptorbinding preference[J]. EMBO journal，2015，34（12）：1661-1673.

[3] STEVENS J，BLIXT O，TUMPEY T M，et al. Structure and receptor specificity of the hemagglutinin from an H5N1 influenza virus[J]. Science，2006，312（5772）：404-410.

[4] LI Z，JIANG Y，JIAO P，et al. The NS1 gene contributes to the virulence of H5N1 avian influenza viruses[J]. Journal of virology，2006，80（22）：11115-11123.

[5] YAN J，LU Y，MAO H，et al. Pathogenic and molecular characterization of the H5N1 avian influenza virus isolated from the first human case in Zhejiang province，China[J].Diagnostic microbiology and infectious disease，2007，58（4）：399-405.

[6] HUANG K，ZHU H，FAN X，et al. Establishment and lineage replacement of H6 influenza viruses in domestic ducks in southern China[J]. Journal of virology，2012，86（11）：6075-6083.

[7] HUANG K，BAHL J，FAN X H，et al. Establishment of an H6N2 influenza virus lineage in domestic ducks in southern China[J]. Journal of virology，2010，84（14）：6978-6986.

[8] WANG G，DENG G，SHI J，et al. H6 influenza viruses pose a potential threat to human health[J]. Journal of virology，2014，88（8）：3953-3964.