扁桃种皮组织结构和超微结构观察

张宏平，张晋元，吴国良，赵彦华

(1.山西晋城职业技术学院，山西 晋城 048026；2.河南农业大学 园艺学院，河南 郑州 450002；3.山西农业科学院 果树研究所，山西 太原 030031)

扁桃(AmygdaluscummunisL.)是世界重要的干果，产量居四大干果之首[1-2]。扁桃食用部位为种子。种皮是种仁营养输送的部位，影响着扁桃种子的质量和产量。目前，系统研究扁桃种皮组织结构和超微结构尚未报道，主要集中在遗传育种和栽培管理方面[2-3]。在种皮微观领域方面，桃和核桃上有所报道[4-6]。本试验以扁桃种皮为材料，系统观察其不同时期组织结构和超微结构的特点，达到丰富干果类种皮微观领域研究；通过观察扁桃种皮韧皮部SE/CC复合体与周围薄壁细胞的细胞学联系，对其糖卸载方式作出初步判断，为提高扁桃的质量和产量提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验材料取自运城万荣县董谋为果园。扁桃进入盛花期后，于4月初每隔10 d取材1次，直到9月中旬扁桃果实成熟。切片材料于中国农业大学和南京农业大学的电镜室进行观察。

1.2 试验方法

1.2.1 透射电镜样品制备方法 透射电镜组织包埋块的制作方法在吴国良[5]的基础上稍做改动。扁桃种皮维管束组织用双面刀切成2～3 mm3小块后，在4 ℃下用2.5%的戊二醛(浓度为2 mol/L的磷酸缓冲液配制，pH 7.2)固定7 h，抽气直到切块完全下沉。用1 mol/L的磷酸漂洗液进行漂洗，4 ℃下1%锇酸固定过夜后，用1 mol/L磷酸缓冲液漂洗3次，每次15 min；4 ℃下，将材料置于体积分数为50%、70%、90%的乙醇中分别脱水20 min；纯丙酮室温过渡，分3次，每次15 min；Spurr(Dow Chemical co，USA )包埋，68 ℃下聚合8 h。修块后，用切片机(型号LKB-8800)切成70 nm厚的小片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染法染色，电镜观察(型号为JEOL-1230和日立H-7650)。

1.2.2 半薄切片样品制备方法 在透射电镜做好包埋块的基础上，用超薄切片机(型号KLB—V)进行半薄切片，厚度0.4 μm。载玻片上滴入水滴，挑入薄片，在60 ℃温台上烘干，使切片很好地贴于载玻片上。用亚甲蓝/天青A(pH6.9)/番红(pH9.1)进行染色[7]，水洗去多余染料，加拿大树胶封片，Olympus显微镜下进行拍照观察。

2 观察结果

2.1 不同时期扁桃种皮组织结构观察

扁桃种皮从早期到末期可明显的分为3层结构，在不同时期各层细胞特征变化相当明显。在发育早期，扁桃种皮可以明显的辨别出细胞层数，外种皮为3层细胞组成，中种皮为18～20层细胞，内种皮由1层细长形细胞组成。扁桃外种皮细胞较小，过渡层与外种皮相邻，细胞排列整齐，细胞体积小。中种皮细胞排列比较凌乱，细胞间隙较大，并出现为数不少的含酚细胞，中种皮细胞层数最多，其面积占到了整个种皮横截面的4/5还多。维管束分布于中种皮靠近内种皮一侧，其中导管和筛管几乎成并列排列，属于并列维管束类型。在维管束周围有大量的厚壁细胞存在。与扁桃种皮其他各层相比，扁桃内种皮细胞体积巨大，排列不整齐，细胞大小悬殊，细胞内含物较少(图1，a)。

a.早期扁桃种皮组织结构；b.中期扁桃种皮组织结构；c.为b的放大图像；d.后期扁桃种皮组织结构；e.末期扁桃种皮组织结构；f.为e的放大图像。E.外种皮；T.过渡层；M.中种皮；EN.内种皮；C.导管；ST.筛管；TC.传递细胞。a.The early almond seed capsule tissue structure;b.The middle almond seed capsule tissue structure;c.It is the figure b magnified image;d.The middle-last almond seed capsule tissue structure;e.The last almond seed capsuletissue structure；f.It is the e magnified image.E.Episperm;T.Transition layer;M.Mesosperm;EN.Endopleura;ST.Sieve tube;TC.Transfer cell.图1 扁桃种皮组织结构Fig1. The almond seed capsule tissue structure

扁桃种皮发育到中期，外种皮细胞最外层已经木质化成硬皮，内部2层细胞透明化，细胞质少，只能看到细胞核。过渡层细胞变化不明显，只是细胞壁加厚(图1，b)。中种皮普通薄壁细胞进一步发育，细胞质充满了整个细胞，细胞排列紧密，胞间隙变小(图1，b、c)。中种皮的维管束发育完全，筛管中的伴胞染色较深，导管呈规则的圆形(图1，b、c)。内种皮细胞进一步增大，根据细胞特征可以分为2种类型：开始出现发达内嵴的传递细胞和内含很丰富的薄壁细胞，二者在体积上都进一步增大(图1，b)。

扁桃种皮发育到后期时，外种皮细胞进一步木质化成为一个整体，外种皮最外层细胞木质化加重，内部2层细胞被染成蓝色。过渡层细胞也木质化，邻近外种皮的中种皮细胞已经完全解体成为空腔状，其他中种皮细胞没有解体，细胞体积明显缩小，细胞排列更紧凑。内种皮的细胞变化是：出现的传递细胞内嵴进一步发达，另一类细胞壁也有加厚的趋势。与中期相比，中后期整个种皮的体积收缩变小，木质化程度加重(图1，d)。

扁桃种皮发育到末期，外种皮木质化更加严重，2层木质化的细胞染成黑色，镶嵌在外种皮中。过渡层细胞显著的特点是从中后期到末期融为一个整体，已经看不出过渡层。中种皮细胞大部分解体，仅有靠近内种皮的2层细胞存在；内种皮普通薄壁细胞中的细胞内含物减少，空泡化明显，但是细胞壁次生加厚的特殊细胞已经完全表现出传递细胞的特征(图1，e、f)。

2.2 扁桃种皮超微结构观察

2.2.1 扁桃种皮薄壁细胞超微结构 在扁桃种皮发育的早期，细胞质浓厚，高尔基体、线粒体等大量存在，在细胞之间存在于大量的胞间连丝(图2，a)。不同类型的囊泡在扁桃种皮早期出现，如规则的同心圆囊泡、边缘加厚的同心囊泡等(图2，a)。在扁桃种皮发育的中期，最突出的特点就是细胞中增加了大量线粒体，细胞核大而清晰，内质网、各种细胞器散布在细胞质中，细胞之间的胞间连丝较为发达(图2，b)。在末期，扁桃细胞中的细胞器开始部分出现降解，线粒体也开始降解，但细胞之间的胞间连丝还很发达，扁桃外种皮细胞已完全木质化，黑色物质充满了整个细胞，细胞壁木质化，成为种子很好的保护层(图2，c、d)。

a.早期扁桃种皮薄壁细胞；b.中期扁桃种皮薄壁细胞；c.末期扁桃种皮薄壁细胞；d.末期扁桃外种皮木质化细胞。CW.细胞壁；M.线粒体；N.细胞核；PD.胞间连丝；Ve.囊泡；G.高尔基体；L.木质化；BS.黑色物质。a.The early almond seed capsule ultrastructure；b.The middle almond seed capsule ultrastructure;c.The late almond seed capsule parenchyma cells；d.The late almond seed capsule lignified cells.CW.Cell wall;M.Mitochondria;N.Nucleus;PD.Plasmodesma;Ve.Vesicles;G.Gologiosome;L.Lignification;BS.Black substance.图2 扁桃种皮超微结构图版Fig.2 The almond seed capsule ultrastructure

2.2.2 扁桃种皮SE/CC复合体结构 扁桃种皮韧皮部SE/CC复合体中，SE细胞器较少，CC中的细胞质浓，颜色较深，拥有大量的线粒体和细胞核。2～3个比较大的囊泡存在扁桃种皮CC的细胞中，扁桃种皮中期的液泡代替了CC早期的囊泡位置(图3，c、d、g)。在末期时，扁桃种皮SE细胞中出现了大量淀粉粒，SE与SE的筛孔和筛板明显，并且筛孔未被胼胝质堵塞(图3，f)。扁桃种皮SE/CC复合体是典型结构，在二者之间的胞间连丝构造属于常见的类型，即SE一边为单通道结构，CC一边为多通道结构(图3，d、g)。在末期，SE/CC复合体中细胞壁变厚占据了大量的细胞间隙(图3，h)，胞间连丝出现堵塞的现象，在扁桃种皮SE/SE细胞之间，部分胞间连丝是相通的，部分被胼胝质堵塞(图3，e、f)，可见SE/CC、SE/SE复合体由胞间连丝和胼胝质共同调控物质运输和信息交流。

2.3 扁桃种皮维管束SE/CC复合体与周围韧皮薄壁细胞之间的细胞学联系

a.早期的扁桃种皮维管束；b.为a的放大图像；c.早期的扁桃种皮SE/CC复合体；d.中期扁桃种皮SE/CC复合体；e.末期扁桃种皮维管束；f.末期扁桃种皮SE/SE；g.早期扁桃种皮SE/CC复合体纵切图；h.末期扁桃种皮SE/CC。CC.伴胞；CW.细胞壁；M.线粒体；N.细胞核；PD.胞间连丝；PP.韧皮部周围薄壁细胞；S.淀粉颗粒；SE.筛管；Ve.囊泡。a.The early almond seed capsule vascular bundle ultrastructure；b.It is the figure a magnified image；c.The early almond seed capsule SE / CC complex；d.The middle almond seed capsule SE/CC complex；e.The last almond seed capsule vascular bundle ultrastructure；f.The last almond seed capsule SE /SE ultrastructure；g.The early almond seed capsule SE / CC complex slippery image；h.The last almond seed capsule SE/CC complex.CC.Companion cell;CW.Cell wall;M.Mitochondria;N.Nucleus;PD.Plasmodesma；PP.Phloem parenchyma cell;S.Starch;SE.Sieve element;Ve.Vesicles.图3 扁桃种皮维管束结构图版Fig.3 The almond seed capsule vascular bundle ultrastructure

在扁桃种皮SE/CC复合体与周围薄壁细胞联系的观察中可看到：SE/CC复合体与韧皮部周围薄壁细胞间存在胞间连丝，并且相当丰富，韧皮部中大量的薄壁细胞之间胞间连丝很发达(图3，a、b、c)，故其存在密切的共质体联系。在扁桃果皮中同时观察到SE和SE之间也存在胞间连丝，并分布于细胞壁加厚处(图3，d、e、f)。在扁桃种皮后期，SE/CC扭曲折叠，细胞壁增厚，占据了大量的胞间隙，但SE/CC之间胞间连丝没有堵塞(图3，h)。扁桃种皮维管束中的SE/CC复合体比较典型(图3，d、g)。在同一个SE和SE之间的有的胞间连丝相通，有的是堵塞(图3，d、e、f)。

3 结论与讨论

3.1 扁桃种皮组织结构

扁桃种皮分为内、中、外3层细胞，外种皮由3层细胞组成，中种皮有18～20层细胞，内种皮由1层细胞组成。这与已报道的桃种皮不一样，外种皮最为明显，桃外种皮有11～13层[6]。扁桃外种皮细胞小；发育至中期，外层细胞木质化；在末期外种皮细胞完全木质化。中种皮由薄壁细胞和维管束组成，细胞间隙比较大；细胞层数较多，中种皮面积占到了整个种皮的4/5多，在后期中种皮解体严重，在末期中种皮细胞全部解体。内种皮细胞在3层细胞中体积最大，有细胞壁特殊增厚的传递细胞出现，分布有大量的次生壁加厚明显的传递细胞。与桃种皮的细胞发育特点相比，差异较大[6]。

3.2 扁桃种皮薄壁细胞超微结构

扁桃种皮薄壁细胞发育特点与张宏平等[6]报道的相似。在扁桃种皮早期细胞质浓，存在大量的高尔基体、线粒体和不同类型的囊泡。中期细胞核大而清晰，内质网多、各种细胞器散布在细胞中，胞间连丝发达，显示了细胞之间物质及能量交换活动旺盛。末期部分细胞器降解，但胞间连丝还很发达。外种皮细胞已完全木质化，黑色物质充满了整个细胞，细胞壁木质化，这种现象在桃种皮、核桃种皮中曾有报道[5-6]。

3.3 扁桃种皮SE/CC复合体及卸载方式

扁桃种皮SE/CC复合体之间胞间连丝在SE一侧为多通道，在CC一侧为单通道，如葡萄[8-9]、苹果[10-12]、核桃[5]一样。胞间连丝不仅是转运有机营养的通道，而且也是调节物质和信息流的通道。在核桃SE与SE之间也可以看到被胼胝质堵塞的筛板的胞间连丝，形状如面包[5]，在扁桃也观察到一些SE/SE之间有胞间连丝被堵塞的现象。这些复杂的胞间连丝结构上还有大量的蛋白，也包括细胞骨架的组成成份，单一的胞间连丝和分枝状的胞间连丝在作用上有很大的不一样[13]，近些年来已被证实[13]。所有这些SE/CC复合体、SE/SE之间的复杂胞间连丝的关系及具体作用需要进一步研究。

在扁桃种皮韧皮部薄壁细胞与SE/CC复合体之间存在发达的胞间连丝，可见共质体系联系密切，由此初步推断扁桃种皮糖卸载的方式为共质体，通过浓度梯度压力[14-15]，扩散到扁桃胚中，提供种子所需的营养。另外，超微结构观察确定韧皮部卸载方式还是不够的，仍需要酸性转化酶胶体金定位和活体组织荧光示踪试验来验证结果。

3.4 扁桃种皮细胞衰老方式

植物细胞衰老机制和假说主要分为6种[16]，但是在组织结构和超微结构水平上的变化表现为2种：第一类是常见的细胞软化，即细胞壁解体，细胞膜的粘性变化[19]，细胞器降解，更进一步囊泡化和空泡化，细胞器模糊[18-19]；另外一类是细胞木质化，包括细胞质解体，细胞壁加厚，细胞扭曲变形，细胞被黑色致密的物质等充满并木质化。以果肉为食用部位的，大部分属于第一类细胞衰老方式，如：苹果、葡萄、草莓、李、杏；而食用部位为种子的果实大都属于第二类。本试验研究的扁桃种子细胞衰老方式属于第二类，以上结果通过本试验组织结构和超微结构观察验证(图1，d、f、f；图2，c、d)。

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