小脑锌指结构4在子宫内膜癌组织中的表达及意义

马剑，孔繁菲，丛蓉，马晓欣

（中国医科大学附属盛京医院妇产科，沈阳 110020）

子宫内膜癌在女性常见的致命恶性肿瘤中居第五位，其发病率逐年增高［1］。子宫内膜癌的治疗以手术为主，放化疗及激素等药物治疗为辅，但对于晚期转移或复发性子宫内膜癌患者，由于失去手术时机，治疗失败率仍然很高。随着对子宫内膜癌发生发展分子机制的深入研究，越来越多的分子靶向药物已得到初步的临床应用，取得了一定的疗效［2-3］。有关子宫内膜癌的发生、发展是一个极其复杂的多因素过程，因此，探索子宫内膜癌进展过程中的潜在改变可能为子宫内膜癌的分子治疗以及判断内膜癌的预后和检测提供新的策略［4］。小脑锌指结构 （zinc finger of the cerebellum，ZIC） 家族基因包括5个成员，ZIC基因各自编码锌指转录因子，组成5个Cys2His2锌指结构域。ZIC蛋白被认为在基因表达监管中发挥作用，影响ZIC基因表达，从而影响其他多种基因的表达［5］。ZIC基因在肿瘤发生发展过程发挥着重要作用，与多种肿瘤，包括胃癌、肝癌等的发生、发展密切相关［6-7］。ZIC4作为ZIC基因家族中的重要一员，在多种肿瘤，如肺癌、头颈癌、卵巢癌等［8-10］中扮演着重要的角色。然而，ZIC4在子宫内膜癌中的表达和意义目前暂无报道。本研究拟检测子宫内膜癌、非典型增生子宫内膜以及正常子宫内膜组织中ZIC4的表达，并分析ZIC4表达与临床病理资料之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象：收集中国医科大学附属盛京医院2011至2017年期间因子宫内膜癌、非典型增生和宫颈上皮内瘤变Ⅲ级 （cervical intraepithelial neoplasiaⅢ，CINⅢ） 行手术切除的子宫内膜组织。制成石蜡标本，共160例，相应分为子宫内膜癌组 （n= 110）、非典型增生子宫内膜组 （n= 20） 和正常对照组 （n=30） 。患者术前均未接受放化疗及激素治疗，且已经病理确诊。子宫内膜癌组手术临床分期及病理分级（FIGO 2009）为Ⅰ期 30例，Ⅱ期 30例，Ⅲ期 30 例，Ⅳ期20例 ；组织学分级 （WHO标准）为高分化子宫内膜癌38 例，中分化以及低分化子宫内膜癌72 例；淋巴结转移阳性27 例，无淋巴结转移 83 例；浸润肌层＜1/2共61 例，浸润肌层≥1/2 共49 例。从The Cancer Genome Atlas （TCGA） 数据库获取542例子宫内膜癌患者生存信息并分析。本研究已通过中国医科大学附属盛京医院伦理委员会的批准。

1.1.2 主要试剂：ZIC4兔抗人一抗购自北京博奥森公司，免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接 （S-P） 试剂盒购自福州迈新试剂公司，DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥公司。

1.2 方法

1.2.1 S-P法免疫组化检测：标本经固定、石蜡包埋，制备成子宫内膜石蜡标本，5 μ m 厚连续切片。常规脱蜡，TritonX-100 破核，柠檬酸钠缓冲液进行抗原修复，进而按免疫组化S-P试剂盒说明书进行操作，ZIC4一抗浓度为 1∶800，DAB显色，苏木素复染，自来水冲洗蓝化，梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片固定。

1.2.2 结果判定：采用双盲评分法对免疫组化结果进行判定，并由2位观察者阅片，以确保实验可信性。ZIC4 蛋白阳性反应颗粒定位于细胞核。在 400 倍视野下随机选取 5个视野，按阳性细胞着色强度进行评分，无着色计为 0 分，浅黄色计为 1 分，黄色计为2 分，棕黄色以及棕褐色计为 3 分。每张切片在 400倍光学显微镜下取3 个高倍视野观察，按阳性细胞数所占百分比评分，评分后取均值，阴性计为 0 分，阳性细胞百分比≤10% 计为 1 分，＞10%～50% 计为2 分，＞50%～75% 计为 3 分，＞75% 计为 4分。取2项评分的乘积作为总分，≤2 分为阴性 （ - ），3～4分为弱阳性 （ + ），5～8 为中等阳性 （ ++ ） ，9～12 分为强阳性（+++ ） 。-/+为低表达，++/+++为高表达。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0 软件进行统计学分析。计数资料的比较采用χ2或 Fisher 确切概率检验。分析生存情况采用 Kaplan-Meier法。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 子宫内膜组织中ZIC4的表达

ZIC4蛋白主要表达于子宫内膜组织细胞核中，阳性表达呈棕黄色、棕褐色均匀颗粒状或片状。免疫组化结果显示，子宫内膜癌组ZIC4阳性率［ 94.5%（104/110） ］和非典型增生组阳性率［55% （11/20） ］显著高于正常对照组［23.3% （7/30） ］ （P＜ 0.001，P=0.022 3） 。见图1。

2.2 ZIC4在子宫内膜癌中的表达水平与临床病理参数之间的关系

图1 ZIC4在各组子宫内膜组织中的表达 SP×400Fig.1 ZIC4 expression in the endometrial tissue from each group SP×400

如表1所示，高分化子宫内膜癌组织中ZIC4高表达率明显低于中低分化子宫内膜癌，早期 （Ⅰ～Ⅱ期） 内膜癌组织中ZIC4 高表达率明显低于晚期（Ⅲ～Ⅳ期） 内膜癌，肿瘤浸润深度≥1/2子宫内膜癌组织中ZIC4高表达率明显高于浸润＜1/2者，有淋巴结转移子宫内膜癌患者ZIC4的高表达率较无淋巴结转移者显著升高，差异均有统计学意义 （均P＜0.05） 。而ZIC4表达水平与年龄无相关性 （P＞ 0.05） 。

2.3 ZIC4基因表达的生存分析

对应用TCGA数据库获取的子宫内膜癌患者信息进行单因素Keplan-Meier 分析，结果显示，ZIC4高表达与总体生存期缩短明显相关 （P＜ 0.05） ，见图2。

图2 ZIC4表达与子宫内膜癌患者生存期及无病生存率的单因素Keplan-Meier 分析Fig.2 Kaplan-Meier survival curves of cases with high and low ZIC4 expression levels in patients with endometrial cancer

3 讨论

ZIC基因最早于1994年由ARUGA等［11］在筛选成年鼠小脑cDNA文库时发现，因在小脑颗粒细胞里大量编码锌指蛋白表达而命名为ZIC基因，1995年ZIC基因被克隆［12］。此后，ZIC基因家族的其他成员ZIC2～5逐渐被人们发现［13］。全部5个ZIC基因都具有三外显子结构，其中锌指结构域编码位于每个基因的C-末端。锌指蛋白结构域可以结合DNA序列，也可被Gli锌指蛋白结合，Gli蛋白和 ZIC锌指结构域中也存在类似的特异性结合序列［14-15］。ZIC报告基因的激活在一定程度上依赖于 Gli 靶序列的存在［16］。Gli 蛋白在SHH （ Sonic hedgehog） 信号转导通路中扮演至关重要的角色，在细胞的分化、增殖、迁移侵袭以及凋亡等生理过程中起着举足轻重的作用［17］。ZIC1和ZIC4在人染色体3号 （小鼠染色体9） 紧密连接。ZIC4在转录调控中通常与ZIC1一起工作［18］。PALUSZCZAK等［19］发现头颈癌细胞中ZIC1和ZIC4基因的启动子被甲基化，Wnt信号通路被激活，其中ZIC4甲基化与口腔癌患者淋巴结转移相关，ZIC4的甲基化被认为可能是新的头颈鳞状细胞癌预后指标。已有研究结果表明，血浆DNA的ZIC1启动子甲基化速率对于GC的早期筛选和肿瘤发生的监测具有重要意义。ZIC1启动子甲基化速率和CEA水平 （并行测试） 的组合检测可以提高胃癌的早期诊断率［20］，也有研究［21］认为ZIC1启动子的甲基化可能作为肝癌的潜在生物学指标。此外，在甲状腺癌、结肠癌等肿瘤中均可检测到ZIC1基因表达异常，以及启动子发生甲基化［22-23］。以上研究说明 DNA 甲基化可能是ZIC基因调控的重要机制之一。已有文献［24］报道ZIC1基因在子宫内膜癌组织中过表达，但在正常组织中低表达，ZIC1的表达下调有助于抑制细胞增殖，抑制肿瘤生长。关于ZIC4与子宫内膜癌的相关研究暂无报道。本研究通过免疫组化法检测了ZIC4在不同子宫内膜石蜡组织中的表达，结果表明 ZIC4在子宫内膜癌组织中呈高表达。本研究还分析了ZIC4表达与临床病理资料间的关系，结果发现，ZIC4的表达高低与临床分期、组织分化、肿瘤浸润深度及淋巴结转移等临床病理参数密切相关。同时，本研究分析了ZIC4与子宫内膜癌预后的相关性，结果提示子宫内膜癌中ZIC4高表达可导致预后生存率较差。

综上所述，本研究提示ZIC4与子宫内膜癌的发生、发展及转移密切相关。深入研究ZIC4在子宫内膜癌中的具体作用机制将有可能为子宫内膜癌的治疗以及预后监测提供新的策略。

［1］ SANNI OB，MC MENAMIN UC，CARDWELL CR，et al. Commonly used medications and endometrial cancer survival：a population-based cohort study ［J］. Br J Cancer，2017，117 （3） ：432-438. DOI：10.1038/bjc.2017.207.

［2］ SLOMOVITZ BM，JIANG y，yATES MS，et al. PhaseⅡstudy of everolimus and letrozole in patients with recurrent endometrial carcinoma ［J］. J Clin Oncol，2015，33 （8） ：1-12. DOI：10.1200/JCO.2014.58.3401.

［3］ yU y，HALL T，EATHIRAJ S，et al. In-vitro and in-vivo combined effect of ARQ 092，an AKT inhibitor，with ARQ 087，a FGFR inhibitor ［J］. Anticancer Drugs，28 （5） ：503-513. DOI：10.1097/CAD.0000000000000486.

［4］ VISSER NCM，WERNER HMJ，KRAKSTAD C，et al. Type of vascular invasion in association with progress of endometrial cancer ［J］.APMIS，2017，125（12）：1084-1091. DOI：10.1111/apm.12774.

［5］ CHERVENAK AP，BANK LM，THOMSEN N，et al. The role of Zic genes in neural development ［J］. Mol Cell Neurosci，2004，243 （11） ：205-221. DOI：10.1002/dvdy.24186.

［6］ MA G，DAI W，SANG A，et al. Roles of ZIC family genes in human gastric cancer ［J］. Int J Mol Med，2016，38 （1） ：259-266. DOI：10.3892/ijmm.2016.2587.

［7］ LU SX，ZHANG CZ，LUO RZ，et al. Zic2 promotes tumor growth and metastasis via PAK4 in hepatocellular carcinoma ［J］. Cancer Lett，2017，402：71-80. DOI：10.1016/j.canlet.2017.05.018.

［8］ SABATER L，BATALLER L，SUAREZ-CALVET M. et al. ZIC antibodies in paraneoplastic cerebellar degeneration and small cell lung cancer ［J］. J Neuroimmunol，2008，201-202：163-165. DOI：10.1016/j.jneuroim.2008.01.018.

［9］ JUODZBALyS G，KASRADZE D，CICCIU M，et al. Modern molecular biomarkers of head and neck cancer Part I. Epigenetic diagnostics and prognostics：systematic review ［J］. Cancer Biomark，2016，17 （4） ：487-502. DOI：10.3233/CBM-160666.

［10］ HUANG RL，GU F，KIRMA NB，et al. Comprehensive methylome analysis of ovarian tumors reveals hedgehog signaling pathway regulators as prognostic DNA methylation biomarkers ［J］. Epigenetics，2013，8 （6） ：624-634. DOI：10.4161/epi.24816.

［11］ KIM yS，LEWANDOSKI M，PERANTONI AO，et al. Identification of Glis1，a novel Gli-related，Kruppel-like zinc finger protein containing transactivation and repressor functions ［J］. J Biol Chem，2002，277 （34） ：30901-30913. DOI：10.1074/jbc.M203563200.

［12］ BLANK MC，GRINBERG I，ARyEE E. et al. Multiple developmental programs are altered by loss of Zic1 and Zic4 to cause Dandy-Walker malformation cerebellar pathogenesis ［J］. Development，2011，138 （6） ：1207-1216. DOI：10.1242/dev.054114.

［13］ GRINBERG I，MILLEN KJ. The ZIC gene family in development and disease ［J］. Clin Genet，2005，67 （4） ：290-296. DOI：10.1111/j.1399-0004.2005.00418.x

［14］ MIZUGISHI K，ARUGA J，NAKATA K，et al. Molecular properties of Zic proteins as transcriptional regulators and their relationship to GLI proteins ［J］. J Biol Chem，2001，276 （3） ：2180-2188. DOI：10.1074/jbc.M004430200

［15］ KOyABU y，NAKATA K，MIZUGISHI K，et al. Physical and functional interactions between Zic and Gli proteins ［J］. J Biol Chem，2001，276 （10） ：6889-6892. DOI：10.1074/jbc.C000773200.

［16］ CHERVENAK AP，BANK LM，THOMSEN N，et al. The role of Zic genes in inner ear development in the mouse：exploring mutant mouse phenotypes ［J］. Dev Dyn，2014，243 （11） ：1487-1498. DOI：10.1002/dvdy.24186.

［17］ CHOUDHRy Z，RIKANI AA，CHOUDHRy AM，et al. Sonic hedgehog signalling pathway：a complex network ［J］. Ann Neurosci，2014，21 （1） ：28-31. DOI：10.5214/ans.0972.7531.210109.

［18］ ISHIGURO A，INOUE T，MIKOSHIBA K，et al. Molecular properties of Zic4 and Zic5 proteins：functional diversity within Zic family［J］. Biochem Biophys Res Commun，2004，324 （1） ：302-307. DOI：10.1016/j.bbrc.2004.09.052.

［19］ PALUSZCZAK J，WISNIEWSKA D，KOSTRZEWSKA-POCZEKAJ M，et al. Prognostic significance of the methylation of Wnt pathway antagonists-CXXC4，DACT2，and the inhibitors of sonic hedgehog signaling-ZIC1，ZIC4，and HHIP in head and neck squamous cell carcinomas ［J］. Clin Oral Investig，2017，21 （5） ：1777-1788. DOI：10.1007/s00784-016-1946-5.

［20］ CHEN X，LIN Z，XUE M，et al. Zic1 promoter hypermethylation in plasma DNA is a potential biomarker for gastric cancer and intraepithelial neoplasia ［J］. PLoS One，2015，10 （7） ：e0133906. DOI：10.1371/journal.pone.0133906.

［21］ WANG yy，JIANG JX，MA H，et al. Role of ZIC1 methylation in hepatocellular carcinoma and its clinical significance ［J］. Tumour Biol，2014，35 （8） ：7429-7433. DOI：10.1007/s13277-014-1971-4.

［22］ GAN L，CHEN S，ZHONG J，et al. ZIC1 is downregulated through promoter hypermethylation，and functions as a tumor suppressor gene in colorectal cancer ［J］. PLoS One，2011，6 （2） ：e16916. DOI：10.1371/journal.pone.0016916

［23］ QIANG W，ZHAO y，yANG Q，et al. ZIC1 is a putative tumor suppressor in thyroid cancer by modulating major signaling pathways and transcription factor FOXO3a ［J］. J Clin Endocrinol Metab，2014，99 （7） ：E1163-E1172. DOI：10.1210/jc.2013-3729

［24］ GU X，LIU Q，yANG N，et al. Clinicopathological significance of increased ZIC1 expression in human endometrial cancer ［J］. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2015，35（6） ：898-903.DOI：10.1007/s11596-015-1525-z.