基于ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９构建基因编辑小鼠ｓｇＲＮＡ有效性验证研究

许文豪 周婉 臧敦安 巩雪洁 刘庆华 于孟飞 薛璐 彭勇波

摘要：以小鼠S100A9基因为例，设计针对该基因的sgRNA，体外转录后与Cas9 mRNA通过显微注射入受精卵，选取囊胚期的胚胎，单枚独立进行基因型分析，并综合得出编辑效率。结果表明，显微注射113枚受精卵，其中28枚成功发育到囊胚期，其中有5枚囊胚在特定位点产生了基因突变，总编辑效率为18%。该方法操作简单，可快速对sgRNA活性进行体内验证，并为后续基因编辑小鼠的制备提供基础。

关键词：CRISPR/Cas9;小鼠;sgRNA有效性;囊胚

中图分类号：Q78         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）24-0156-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.24.042           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： The mouse gene，S100A9 was used as an example to illustrate the expected sgRNA design. After in vitro transcription and Cas9 mRNA were injected into the fertilized egg by micro-injection，the embryos in the blastocyst stage were selected，and then performed with genotype identification. The results showed that a total of 113 fertilized eggs were microinjected，of which 28 successfully developed into the blastocyst stage，and five blastocysts produced effective genetic mutations at specific sites. The editing efficiency was 18%. This method is simple to operate，can rapidly verify the sgRNA activity in vivo，and provides a basis for the preparation of subsequent genetically edited mice.

Key words： CRISPR/Cas9; mouse; sgRNA validity; blastosphere

2013年，美国科学家Zhang等首次證明了Cas9核酸酶可以对小鼠和人类细胞DNA进行有效的编辑[1]。CRISPR/Cas9被整合为基因编辑工具后，由于在特异性识别基因组上的目标位点和在目标位点对DNA双链进行切割诱发DNA损伤修复机制这两方面表现出了较强的功能，该系统在包括果蝇、斑马鱼、小鼠、大鼠和人类等在内的各物种的基因组编辑中得到广泛运用[2]。经过改造后的CRISPR/Cas9将原本独立的crRNA及tracrRNA[3]融合为一条单链引导RNA（single-stranded guide RNA，sgRNA）[4]使其更加易于使用。

依靠CRISPR/Cas9技术和胚胎显微注射技术，研究人员可以高效地构建基因敲除、定点敲入及敲减的动物模型，为研究基因功能、药物开发和发病机制研究提供新的材料和策略。但CRISPR/Cas9系统中设计的sgRNA是否具有特异性的胚胎内源引导活性，是成功进行基因编辑中至关重要的环节。现阶段sgRNA的筛选主要有通过sgRNA与Cas9蛋白进行体外酶切验证[5]和利用敲除载体进行细胞系水平验证2种方式[6]。上述2种sgRNA活性验证方式都存在一定的弊端，如前者为体外酶切试验，无法真实反映该sgRNA在细胞内的引导活性;后者由于细胞系选择不同，导致结果存在误差，且制备过程繁琐，耗时耗力。基于目前有关CRISPR/Cas9系统中sgRNA有效性验证存在的不足，本研究以小鼠S100A9基因为例，建立了基于体外培养显微注射后的胚胎[7]和对囊胚时期单胚胎进行基因型分析，从而对sgRNA有效性进行验证。

1  材料与方法

1.1  材料

SPF级4周龄C57BL/6小鼠，SCXK（鄂）2017-0018。

lentiCRISPR V2载体（Addgene公司）、T7体外转录试剂盒（百奥迈科生物技术有限公司）、KSOM培养基（Sigma公司）、PCR引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

1.2  方法

1.2.1  sgRNA设计与合成  根据GenBank中的鼠源S100A9基因（NM_001281852）包含3个外显子，将选择后的外显子片段在麻省理工学院的CRISPR Design软件（http：//CRISPR.mit.edu/）中进行sgRNA设计。根据得分高低顺序依此选择6条候选sgRNA进行后续试验。表1加粗部分为质粒载体骨架序列，gRNA-RP为载体通用下游引物。

1.2.2  体外转录  以lentiCRISPR v2（Plasmid #52961）为模板，PCR扩增上述6条sgRNA，纯化后溶于Nuclease-FreeWater，-20 ℃保存。纯化后的DNA片段通过T7 RNA聚合酶进行体外转录，转录产物经电泳检测后为单一条带，且A260 nm/A280 nm>1.9，A260 nm/A230 nm>2.3。

1.2.3  Cas9 mRNA/sgRNA 显微注射  选取4周龄C57BL/6雌性小鼠提前进行PMSG（10 IU/只）及HCG（10 IU/只）人工超数排卵，并在HCG注射当日与性成熟的雄性C57BL/6小鼠进行合笼，次日取见栓雌鼠解剖。在显微镜下，用针头将输卵管壶腹部刺破，将富集有受精卵的云雾团划出，移至含有0.1%透明质酸M2溶液中消化。将明显破损或异常的受精卵进行剔除，完成后待显微注射用。

将6条sgRNA提前混合，随后与Cas9 RNA按照终浓度10、100 ng/μL再次混匀。选取状态良好的受精卵进行显微注射，调整合适注射压保证外源物质顺利进入胞内，且不使其发生破裂和融解为宜。

1.2.4  胚胎体外培养  注射完成后的受精卵转移至KSOM培养液中37 ℃培养，直至胚胎囊胚期。囊胚期是现阶段人工体外培养胚胎能达到的最后阶段，在该阶段Cas9的切割作用也已基本完成。按单枚胚胎每管收集正常发育中的囊胚期的胚胎，用于后续基因型分析和对sgRNA内源活性进行鉴定。

1.2.5  囊胚总DNA提取及基因型鉴定  按表2中所示比例配置裂解液，并将单枚囊胚置于其中。混合均匀后在55 ℃下裂解20 min，随后95 ℃作用5 min。此时囊胚中的基因组DNA已经充分释放，可进行后续验证试验。

根据sgRNA位点，设计了如下检测引物F（5′-3′）CTCCATTATGTAGCACCCTA，R（5′-3′）TCACCA

TCCTCCCAACTC进行PCR扩增，将PCR产物进行测序鉴定，并分析sgRNA内源活性。

2  结果与分析

2.1  受精卵显微注射及体外培养

经过显微注射后的受精卵，在KSOM溶液中培养至胚胎3.5 d。显微注射113枚受精卵，其中28枚受精卵成功发育到囊胚期。在培养的过程中会出现一定比例的受精卵死亡，一部分原因是注射过程中机械损伤，另外部分原因是2-细胞阻滞（2-cell block）[8]，体外培养的受精卵会由于无法顺利的度过2细胞期而停止发育，从而无法成功获得囊胚期细胞。

受精卵发育过程中，其胞内的遗传物质会增多，与此同时，sgRNA和Cas9复合体在核内对基因组进行切割，可以提取囊胚基因组DNA进行检测，分析sgRNA是否具有内源引导活性。

2.2  靶位点所在区域的片段扩增与鉴定

在成功进行显微注射和体外培养后，获得了28枚囊胚，通过裂解后，取1 μL DNA为模板，利用特异性的检测引物对目的片段进行PCR扩增，1.5%凝胶电泳鉴定（图2）。野生型片段为556 bp，若小于或大于该片段就可能发生了基因的缺失或插入。5号囊胚基因组发生编辑，缺失135 bp;7号囊胚呈现2条目的条带，一条为野生型片段，另外一个等位基因共缺失171 bp;9号囊胚基因组缺失51 bp;16号囊胚基因组缺失54 bp;20号囊胚基因组缺失3 bp。19号囊胚与7号囊胚呈现相似的2条目的条带，但是由于测序失败，未能收集到基因组变换情况。

将PCR扩增得到的片段，进行测序分析，测序峰图及基因编辑情况见图3。

经过测序分析，鉴定的28枚囊胚中出现了5枚囊胚的突变，分别缺失了11 bp至171 bp不等，总切割比例为18%，突变区域与设计位点吻合。

囊胚鉴定可替代常见的引物体外活性检测，因为囊胚期受精卵基因组近乎等同于F0代小鼠基因组，而体外活性检测利用体外的酶切反应无法最真实地模拟胞内环境。直接选取囊胚进行鉴定，也节约了大量等待小鼠孕期及F0代小鼠生长的时间，加快了整个试验进度，提高了试验的准确性。

囊胚鉴定中，检测引物的扩增效率需要通过预试验进行提前验证，避免扩增检测片段時因为引物自身的扩增效率过低而导致囊胚基因组DNA的浪费和流失。

3  小结与讨论

传统的基因敲除小鼠模型是利用同源重组技术，在ES细胞中针对特定的DNA序列进行编辑，由于重组效率低、耗时长，得到的小鼠需要多代回交等原因，大大限制了基因敲除小鼠构建的速度。

2013年Rudolf通过共同注射Cas9 mRNA和 sgRNA到小鼠受精卵中，实现了CRISPR/Cas9技术首次被用于多细胞生物的多基因敲除[9]。利用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除小鼠构建时，只需设计20 bp的gRNA与靶序列DNA互补[9]，Cas9蛋白通过识别靶序列末端的PAM区[10]，即可进行DNA双链的切割。然而在靶基因上往往存在多个可设计和识别的gRNA位点，但是每个gRNA介导的Cas9对DNA切割效率并不一致。由于受体材料为离体胚胎，体外操作具有很高的死亡率，所以提前对gRNA进行活性验证对于利用CRISPR/Cas9技术构建基因编辑小鼠是非常必要的。

本研究利用一种新的sgRNA验证手段，选取显微注射后，囊胚期的细胞进行特定靶点验证，并得出综合编辑效率。该方法可以对靶位点活性进行验证，还可以对上游制备的mRNA质量进行验证，不仅适用于小鼠全基因组编辑时sgRNA活性筛选，也适用于基于CRISPR/Cas9技术的条件下敲除和敲入基因的提前验证。

参考文献：

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[4] JINEK M，CHYLINSKI K，FONFARA I，et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[J].Science，2012，337（6096）：816-821.

[5] 成大欣，徐麗然，于清清，等.一种简单的gRNA体外筛选方法[J].实验动物与比较医学，2018，38（2）：126-129.

[6] 刘  燕，任卫红，王绿娅，等.CRISPR/Cas9基因编辑系统中两种gRNA活性检测方法比较[J].心肺血管病杂志，2016，35（7）：563-568.

[7] 孙芳园.小鼠胚胎体外培养方法的改良[D].河北保定：河北农业大学，2015.

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[9] WANG H，YANG H，SHIVALILA C S，et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering[J].Cell，2013，153（4）：910-918.

[10] ANDERS C，NIEWOEHNER O，DUERST A，et al. Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease[J].Nature，2014，513（7519）：569-573.