顺气化痰活血方对慢性间歇性低氧大鼠主动脉内皮功能的干预作用

张 凯 吉恩生 常 悦 陈玲玲 郭秋红

(河北中医学院，河北 石家庄 050200)

睡眠呼吸暂停综合征(OSAS)是临床上多发的一种对身体多个系统产生严重影响的睡眠呼吸障碍疾病。OSAS患者长期的动脉血氧饱和度波动，造成慢性间歇性低氧(CIH)。 本研究利用CIH动物模型，以中医理论为指导，观察顺气化痰活血方对CIH大鼠主动脉内皮损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 健康雄性SD大鼠60只，体重190～210 g，购于河北医科大学实验动物中心。将大鼠随机分为对照组、模型组、中药组，每组20只。

1.2药物及试剂 顺气化痰活血方组成：柴胡10 g，枳壳10 g，牛膝8 g，桔梗8 g，升麻8 g，葛根30 g，川芎12 g，当归12 g，桃仁12 g，红花12 g，赤芍12 g，浙贝12 g，天麻20 g，苏子12 g，陈皮12 g，半夏12 g，茯苓12 g，天南星12 g，瓜蒌12 g，石菖蒲10 g，黄芩10 g，薄荷10 g。上述药物均采用中药免煎配方颗粒，由广东一方制药有限公司提供。乙酰胆碱(ACh)、硝普钠(SNP)和苯肾上腺素(PE)均购自美国Sigma公司。

1.3造模方法 参照文献〔1〕建立CIH动物模型，间歇性低氧舱采用自动气压调控，程序设计每一低氧复氧循环时间为2 min，前1 min充N2使氧浓度降至9%，后1 min充O2使氧浓度恢复到21%。除对照组大鼠置于正常舱内予空气供气外，其余2组大鼠在每日8～16时放入间歇性低氧舱中，共21 d。

1.4给药方法 各组大鼠普通饲料喂养，自由进水，于造模第1天开始灌胃给药。对照组、模型组给予生理盐水1 ml/100 g；中药组给予顺气化痰活血方1 ml/100 g(生药量45 g/kg，相当于成人剂量10倍)。每日灌胃1次，连续21 d。于最后1次灌胃给药后，禁食不禁水12 h，麻醉状态下打开胸腔，快速剥取胸主动脉，用于各项指标检测。

1.5主动脉组织一氧化氮(NO)含量测定 用半自动分光光度计，硝酸还原酶法测定，以μmol/g 为单位。

1.6主动脉组织ET-1蛋白表达检测 采用Western印迹法，提取总蛋白，取80 μg进行电泳，转膜，5%胎牛血清(BSA)封闭，孵育一抗：内皮素(ET)-1(1∶100)、GAPDH(1∶500)，TBST洗膜10 min×4次；孵育相应二抗，TBST洗膜10 min×4次。加入电光学发光(ECL)，成像系统记录并分析结果。

1.7主动脉HE染色 将主动脉用10%甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，HE染色，光镜下组织学观察。

1.8主动脉血管环舒张反应性测定 制备3 mm长主动脉血管环，置于盛有8 ml K-H液的浴槽中，在1.5 g张力下稳定60 min，以10-6mol/L PE刺激血管环，达到最大张力(Eo)后，给予10-6mol/L ACh或SNP，记录血管张力(EX)，并计算最大血管舒张率：△E(%)=(Eo-EX)/Eo×100%。

1.9统计学方法 利用SPSS13.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组主动脉组织NO含量比较 与对照组〔(9.71±1.33)μmol/g〕比较，模型组主动脉组织NO含量显著降低〔(7.52±0.99)μmol/g,P<0.01〕；与模型组比较，中药组NO含量显著升高〔(9.16±1.51)μmol/g,P<0.05〕。

2.2各组主动脉组织ET-1蛋白表达比较 与对照组(0.75±0.26)比较，模型组显著增加(1.26±0.30，P<0.01)；与模型组比较，中药组显著降低(0.78±0.27，P<0.01)。见图1。

2.3各组主动脉形态学比较 对照组主动脉结构正常，内膜光滑，内皮细胞完整、排列有序；模型组主动脉壁显著增厚，内皮细胞部分肿胀、脱落，内膜明显受损；中药组主动脉壁结构显著恢复，内膜光滑完整、内皮细胞扁平连续。见图2。

图1 各组主动脉组织ET-1蛋白表达

图2 各组主动脉形态学变化(HE，×400)

2.4各组主动脉血管环舒张功能比较 经PE预刺激血管环收缩后，与对照组比较，模型组主动脉环对ACh内皮依赖性舒张反应明显降低(P<0.01)，经中药处理后的CIH大鼠主动脉环对ACh内皮依赖性舒张反应明显高于CIH大鼠(P<0.01)。各组主动脉环对SNP的舒张反应差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组主动脉血管环对ACh、SNP诱导的血管舒张率比较

与对照组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01

3 讨 论

OSAS中医称鼾症，由于睡眠时频繁气道阻塞，气机循环运行平衡被打破。故气血逆乱，清浊相干，痰瘀阻塞为其主要病机，疏肝理气、活血清热、化痰开窍为其有效治法。课题组精心筛选了相应药物组成顺气化痰活血方，经临床运用，疗效满意。方中以柴胡、桔梗、枳壳、牛膝，有升有降，疏理气机；升麻、葛根，皆为辛散之品，取其“能散能行”之功，以发散行气活血，升麻佐柴胡可调左右之清气运行。桃仁、红花、当归、川芎、赤芍，活血化瘀，以针对患者气血阻滞之证。患者气郁久而化热，加之患者多为痰湿体质，故用陈皮、半夏、天南星、茯苓、浙贝、苏子、瓜蒌实、石菖蒲、黄芩，清热化痰，散结开窍，薄荷引药到咽喉。研究报道CIH可损伤内皮细胞，导致内皮功能紊乱〔2，3〕。血管内皮依赖性舒张反应的损伤是血管内皮功能受损的一个重要方面。与我们以往研究结果相同〔4〕，CIH损伤了血管内皮功能，从而使血管对内皮依赖性血管舒张反应减弱，而对血管平滑肌功能未产生明显影响。顺气化痰活血方可有效改善CIH后内皮依赖性血管舒张功能。ET-1、NO作为血管内皮细胞受损的敏感性标志物〔5〕，CIH后主动脉ET-1蛋白表达显著增加，NO含量降低。本研究显示，顺气化痰活血方可有效调节主动脉内皮细胞ET-1/NO分泌，提示其可通过降低ET-1蛋白水平，增加NO含量以减轻血管内皮损伤程度，改善血管内皮功能。

1Liu Y，Ji ES，Xiang S,etal.Exposure to cyclic intermittent hypoxia increases expression of functional NMDA receptors in the rat carotid body〔J〕.Appl Physiol(1985)，2009；106(1)：259-67.

2Saarelainen S，Seppala E，Laasonen K，etal.Circulating endothelin-1 in obstructive sleep apnea〔J〕.Endothelium，1997；5(2)：115-8.

3Zamarron-Sanz C，Ricoy-Galbaldon J，Gude-Sampedro F，etal.Plasma levels of vascular endothelial markers in obstructive sleep apnea〔J〕.Arch Med Res，2006；37(4)：552-5.

4Guo QH，Tian YL，Wang Z，etal.Endothelin receptors in augmented vasoconstrictor responses to endothelin-1 in chronic intermittent hypoxia〔J〕.Clin Exp Pharmacol Physiol，2013；40(7)：449-57.

5Ozard JR，Part ML.The role of nitric oxide in the regional vasodialtor effects of endothelin-1 in the rat〔J〕.Br J Pharmacol，1992；105(3)：744-50.