HID-Ion AmpliSeqTMSNP-124个体识别试剂盒在降解检材中的应用

（岳阳市公安局刑侦支队 刑事科学技术研究所，湖南 岳阳 414000）

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）作为第三代遗传标记，在人类基因组中分布广泛，突变率低，广泛应用于遗传学、药物学、人类进化及法医学等研究[1]。相对于STR基因座的高突变率及片段检测要求，学者预测在未来SNP将替代STR基因座成为法医学研究及应用的主要遗传标记[1]。目前，法医学常用的SNP检测技术如SNPlex、SNapShot、Massarray等，最多只能对几十个SNP位点同时进行检测[1-3]，从而限制了SNP位点的广泛使用。本研究中，HID-Ion AmpliSeqTMSNP-124个体识别试剂盒作为基于二代测序Ion Torrent PGM平台开发的第一个商业化SNP检测试剂盒，包含90个已验证的全球通用常染色体SNP位点和34个Y染色体系统发育树上最大单倍型SNP位点。目前，该试剂盒在中国人群中的数据验证已完成，结果显示该试剂盒中所含有的大部分SNP位点多态性丰富[4]。本研究尝试采用该试剂盒对日常检案工作中无法获取完整DNA分型的降解检材进行检测。

1 材料与方法

20例降解检材均来自于岳阳市公安局刑侦支队刑事科学技术研究所，采用QIAamp血液样本抽提试剂盒（德国Qiagen公司）提取DNA，用QuantifilerTMHuman DNA定量试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）进行DNA定量。阳性标准品采用9948。

毛细管电泳检测：对提取的DNA采用HuaxiaTMPlatinum PCR扩增试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）进行23个常染色体STR基因座的检测，具体操作详见试剂盒说明书。PCR产物在3500xL基因分析仪（美国AB公司）上进行基因分型检测。检测成功基因座要求等位基因相对荧光单位（relative fluorescein unit，RFU）大于50，若为杂合子，其均衡性大于60%[4]。

二代测序检测：采用HID-Ion AmpliSeqTMSNP-124个体识别试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）对上述20份检材进行检测分析。具体操作为DNA文库构建、文库定量、乳液PCR反应、文库富集、测序及结果分析。其中，DNA文库构建采用Ampliseq技术及相应的Ion AmpliSeqTM2.0-96LV文库制备试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司），最终文库构建 PCR 体系为 20 μL，含 4 μL 5× Ion AmpliSeq HiFi反应混合 液，10 μL 2× HID-Ion AmpliSeqTMIdentity Panel SNP-124引物混合物，DNA含量为10 ng以内，其余体积用去离子水补齐。文库构建的PCR条件：99℃ 2 min；99℃ 15 s，60℃ 4 min，23个循环；产物10℃保存。扩增产物采用2μL FuPa对引物进行部分消化，并进行磷酸化。处理条件：50℃10min，55℃ 10min，60℃ 20min，10℃保存，保存时间不宜超过1h。之后，加入2μL已提前稀释的Barcode、4 μL Switch Solution以及2 μL DNA连接酶，总反应体积为30μL。处理条件：22℃ 30min，72℃ 10min，10℃保存。产物在1h内进行纯化处理或者于-20℃冷冻保存，采用实时定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）对文库进行精确定量。乳液PCR扩增体系见表1。

按照表1将PCR体系准备好后，再加入100μL充分振荡混匀的Ion PGMTMTemplate OT2 200 Ion SphereTMParticles（美国Thermo Fisher Scientific公司），15 min内在Ion OneTouchTM2乳液PCR仪上选择“Ion PGMTMTemplate OT2 200 Kit”选项进行乳液PCR，时间约8 h。产物取出时间不超过16 h（从反应开始计时）。之后在Ion OneTouchTMES仪器（美国Thermo Fisher Scientific公司）上进行ISP磁珠富集。富集后的文库在Ion Torrent PGM仪器（美国Thermo Fisher Scientific公司）上采用“Ion PGMTMSequencing 200 v2”程序进行测序检测。Flow数为500。采用HID_SNP_Genotyper.42（v4.2）（美国Thermo Fisher Scientific公司）对测序数据进行分析。检测成功位点要求测序reads数大于100，杂合子均衡性大于60%[4]。

表1 乳液PCR体系配置

2 结果与讨论

阳性标准品9948采用常规毛细管电泳检测和二代测序技术检测均可以获得完整的分型结果。其中，9948在23个STR基因座的分型结果与试剂盒说明书中所提供的一致，9948在124个SNP位点的分型结果与文献[4]中提供的结果一致，表明上述方法的准确性和重复性可满足实际工作需要。

20例降解样本的检测结果见表2。其中，采用毛细管电泳检测均不能获得完整的分型结果，检测成功的基因座数目为5～20个，即基因座检测成功率为21.7%～87.0%，平均检测成功率为45.8%。对于杂合子分型，采用等位基因峰值较低与等位基因峰值较高的峰高比值进行均衡性评估，单个样本的杂合子均衡性范围分布为60.8%～75.6%，20个样本的平均杂合子均衡性为66.1%。对于上述20份样本采用二代测序的结果表明：7份样本可以获取完整分型，即在124个SNP位点上均有测序信号峰，且reads数大于100；对于检测到两个等位基因信号值的分型，采用测序信号低的等位基因reads数与测序信号高的reads数的比值进行均衡性评估，均高于60%。最低的测序成功率为1号样本（42.0%），杂合子均衡性为78.6%，检测到的测序数据均真实可信。20份样本的平均检测成功率为82.7%，平均杂合子均衡性为74.8%，相较于毛细管电泳差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 20例降解样本采用毛细管电泳和二代测序检测的结果

研究结果表明，当DNA发生降解时，采用常规毛细管电泳进行检测，常发生基因座检测不完全的现象，主要原因在于：毛细管电泳检测主要依靠对片段的大小进行判别分析，在体系设计时需根据可选荧光素数量及片段的大小差异进行排列分布。当DNA发生降解时，大片段常常无法获取有效扩增片段。本研究中HID-Ion AmpliSeqTMSNP-124个体识别试剂盒中含有的SNP位点对于片段的大小无要求，可以将其设计得尽量短，其中常染色体SNP位点的平均文库大小为132 bp，Y-SNP位点的平均文库大小为141 bp，对其中7个降解检材可获取完整分型。上述结果均提示，采用二代测序及SNP位点对于降解检材可以获取更为丰富的遗传信息，用于法医学身份识别。