氧化乐果在血液中的分解动力学

李 鹏，王皓玉，毕文姬，夏侯秋锦，柏泽新，国 菲

（1.淄博市公安局刑侦支队，山东 淄博 255000；2.太原市公安局刑侦支队，山西 太原 030001）

氧化乐果（omethoate，OME），又称氧乐果，是有机磷农药的一种，能经皮肤、呼吸道、消化道进入体内，抑制胆碱酯酶活性，使乙酰胆碱在组织内蓄积而引起中毒，多见于经口服中毒[1-3]。在氧化乐果中毒案件中，由于送检不及时或实验室内部因素往往会使检材不能及时进行检验。同时，由于案件的需要，常常要求对所送检材进行再次检验或多次检验从而确定是否为氧化乐果中毒死亡。毒物会发生分解，需对保存检材中分解动力学进行研究，明确保存检材中毒（药）物的检出时限、最佳存储条件，对于推断中毒（死亡）当时或检材采取当时体内或检材内的毒（药）物浓度意义重大[4]。目前国内外有关氧化乐果的研究报道主要集中在中毒情况、中毒治疗以及检测方法的研究[5-7]，而关于氧化乐果的分解动力学研究仅见一篇报道[8]，并且为单一浓度氧化乐果在犬血中的研究，没有系统全面地分析不同浓度氧化乐果在人血中的分解动力学规律。本研究通过检测人血中5种不同浓度的氧化乐果在-20℃、4℃、20℃三种保存条件下的含量变化，更系统、全面地研究氧化乐果在人血检材中的分解动力学规律，为氧化乐果中毒（死亡）案件的法医学鉴定提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

4000Q TRAP液质联用仪（美国AB公司），CF16RN落地式多功能离心机（日本日立公司），HY-5涡旋振荡器（常州恒睿仪器设备制造有限公司），移液器（德国Eppendorf公司）。

氧化乐果标准品购于公安部物证鉴定中心，甲醇、乙腈等有机溶剂均为色谱纯，试验用水为超纯水。

1.2 方法

1.2.1 样本处理

于1 mL血样中加入2 mL乙腈，涡旋振荡5 min，再以离心半径6 cm，12 000 r/min，高速离心7 min，取上清液过0.22μm滤膜，待分析。

1.2.2 分析条件

色谱柱为ACQUITY UPLCTMBEH C18柱（2.1mm×50mm，1.7μm，美国Waters公司），流速为0.3mL/min，进样量为2 μL，流动相A为5 mmol/L乙酸铵水溶液，流动相B为甲醇。流动相梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序 （%）

质谱条件：电喷雾离子（electrospray ionization，ESI）源，正离子扫描，检测模式为多反应监测；碰撞气为氮气；气帘气（CUR）为20 psi，喷撞气（CAD）为Medium，离子化电压（IS）为5 500 V，温度（TEM）为500℃，喷雾气（GS1）为50 psi，辅助加热气（GS2）为50psi，接口加热为on，碰撞室入口电压（EP）为10V，碰撞室出口电压（CXP）为6V；保留时间为1.0min；氧化乐果去簇电压为66eV，定性离子对m/z214.0/155.1的碰撞电压为21 eV，m/z214.0/183.1的碰撞电压为24eV，其中m/z214.0/155.1为定量离子对。

1.3 方法学验证

1.3.1 工作曲线和检出限

取空白全血分别添加氧化乐果标准品至质量浓度为 0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、4.00、7.50μg/mL，按1.2节方法操作，以氧化乐果质量浓度为自变量（x）、峰面积为因变量（y）绘制工作曲线，得到回归方程和相关系数，并将信噪比（S/N）＞3的质量浓度作为检出限，10倍的检出限作为定量限。

1.3.2 基质效应、回收率及精密度

精密吸取15份空白全血1mL，按1.2.1节方法进行处理，将提取液分为3组，每组分别添加氧化乐果标准品至质量浓度为0.2、0.5、1.0μg/mL进行测定，以测得的基质提取后添加样品中目标物的峰面积与相同质量浓度对照品的峰面积比值计算基质效应。

精密吸取15份空白全血1mL，分为3组，每组分别添加氧化乐果标准品至质量浓度为0.2、0.5、1.0μg/mL，按1.2节方法操作，以测得的血中氧化乐果的峰面积与相同质量浓度对照品的峰面积比值计算回收率。

取质量浓度分别为0.2、0.5、1.0 μg/mL的添加样品，每个浓度平行测定3份，在同一天内早、中、晚分别按1.2节方法进行分析检测，计算目标物峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），得到日内精密度，连续测3d，得到日间精密度。

1.4 分解动力学模型制备与数据处理

取5份空白血液，分别添加氧化乐果至质量浓度为0.78、1.40、2.30、4.50、7.20μg/mL（通过查询山东省公安厅涉毒药物毒物中毒死亡综合研判系统，确定实验浓度）。将血样分别置于-20℃（冰箱冷冻）、4℃（冰箱冷藏）、20℃（20℃空调房内）三种温度环境中，在0、1、3、4、7、11、15、24、32、40、48、64、80、96和120d进行检测。

采用WinNonlin®v5.2药代动力学软件处理保存血液的平均药物浓度-时间数据。

2 结 果

2.1 色谱图及质谱图

空白血液及添加氧化乐果血样的液质联用仪色谱图如图1所示。结果显示，在选择的实验条件下，血液中的杂质不影响氧化乐果的测定。

图1 空白血液及添加氧化乐果血样的色谱图

2.2 方法学验证

2.2.1 线性范围和检出限

全血添加氧化乐果标准品的线性方程为y=7.3×105x+2200，相关系数（r）为0.9988，线性范围为0.02～7.50μg/mL，检出限为0.002μg/mL。

2.2.2 基质效应、回收率及精密度

不同质量浓度氧化乐果的基质效应、回收率及精密度见表2。

表2 氧化乐果基质效应、回收率及精密度 （%）

2.3 氧化乐果在不同温度下保存的含量变化

在-20℃和4℃条件下质量浓度为0.78、1.40、2.30、4.50、7.20μg/mL的氧化乐果在120d时，含量分别下降至初始质量浓度的30.77%、37.14%、50.87%、72.00%、67.36%和5.13%、3.57%、5.22%、12.89%、13.06%，而20℃条件下，32d后就很难检测到。血液中5种质量浓度的氧化乐果在不同温度下的含量变化见表3。

WinNonlin®v5.2药代动力学软件处理结果显示：在-20℃、4℃和20℃条件下氧化乐果的分解均符合一级动力学过程一室开放模型，可以用Ct=Coe-αt表示（t表示时间，单位为d；Ct为时间t测得的含量；Co表示初始含量；α为分解速率常数；e为自然对数的底数），氧化乐果在不同温度下的分解动力学参数见表4。根据此方程计算所得的理论值与实测值接近，见表5～7。

表3 血中不同浓度氧化乐果在不同温度下保存的质量浓度变化 （n=2，μg·mL-1）

表4 氧化乐果在不同温度下的分解动力学参数

表5 不同质量浓度氧化乐果在-20℃条件下保存的理论值与实测值 （μg·mL-1）

表6 不同质量浓度氧化乐果在4℃条件下保存的理论值与实测值 （μg·mL-1）

表7 不同质量浓度氧化乐果在20℃条件下保存的理论值与实测值 （μg·mL-1）

3 讨 论

有研究[9]表明，保存检材中毒物的分解动力学主要受保存条件的影响，包括温度、时间、器皿类型、防腐剂、pH值等。其中，温度是影响保存生物检材中毒物分解的主要因素之一，毒物在生物检材中的分解速度与保存温度相关。本研究结果表明，不同质量浓度的氧化乐果在-20℃、4℃、20℃保存条件下含量均呈下降趋势，随着温度的升高，氧化乐果降解速度加快。可见，低温保存可延缓氧化乐果的分解，温度在20℃时，生物检材腐败最快，因而毒物代谢也较快，检材被冷藏或冷冻保存时腐败均较慢，分解亦较慢。这也提示日常工作中，由于各种原因导致检材提取后无法立即送检或检验的，应当低温保存。-20℃和4℃条件下，检材中氧化乐果含量也均有下降，因此在低温条件下保存的氧化乐果检材也应尽快送检、检验，以免长时间保存造成氧化乐果分解而无法检测。

本研究结果显示，用所拟合的公式Ct=Coe-αt和参数计算所得血液中氧化乐果的理论值与实测值接近，说明应用血液中毒物分解动力学数学模型和参数可以模拟生物检材中氧化乐果含量随时间的变化，估算检材在保存期间某一时间点的毒物浓度。同时，在20℃保存条件下不同质量浓度氧化乐果的分解速率常数α取平均值0.092，分解动力学方程为Ct=Coe-0.092t，半衰期为7.5 d。在4℃及-20℃保存条件下，将分解速率常数α分为低质量浓度（小于4μg/mL）的分解速率常数α和高质量浓度（大于4μg/mL）的分解速率常数α。在-20℃保存条件下，低质量浓度分解速率常数α平均值为0.007，分解动力学方程为Ct=Coe-0.007t，半衰期为99 d；高质量浓度分解速率常数α平均值为0.003，分解动力学方程为Ct=Coe-0.003t，半衰期为231d。在4℃保存条件下，低质量浓度分解速率常数α平均值为0.025，分解动力学方程为Ct=Coe-0.025t，半衰期为27.7 d；高质量浓度分解速率常数α平均值为0.017，分解动力学方程为Ct=Coe-0.017t，半衰期为40.8d。在氧化乐果中毒（死亡）案件的法医学鉴定中，可根据实际情况，运用适合的分解动力学方程和参数来推断检材提取当时或中毒死亡当时的毒物质量浓度，正确分析和使用毒物分析结果，为氧化乐果中毒（死亡）案件的法医学鉴定提供科学依据。

综上所述，氧化乐果在保存血液中不稳定，分解很快，低温保存可以减缓其分解，分解动力学过程可用一级动力学过程一室开放模型来描述。氧化乐果中毒（死亡）案件的法医学鉴定中，检材应低温冷冻保存，立即送检并检验。如果检材保存时间较长，可用其分解动力学方程和参数估算检材提取或送检当时的氧化乐果浓度。