淫羊藿、女贞子单用及配伍对绝经后骨质疏松症大鼠骨量及内分泌器官的影响

李晓曦 陈宇恒 唐秀凤 高莹莹 于萍 马紫童 刘仁慧

[摘要] 目的 研究淫羊藿、女貞子单用及配伍对绝经后骨质疏松症大鼠内分泌脏器及骨量的影响。 方法 将SPF级雌性SD大鼠48只按随机数字表法分为假手术组、模型组、淫羊藿组、女贞子组、淫羊藿女贞子配伍组（配伍组）、雷洛昔芬组（阳性药组）。除假手术组外，其余各组行双侧卵巢切除术，术后1周开始给予相应的药物治疗至术后13周结束。取右侧股骨进行骨量测定，取子宫、肾上腺、垂体行HE染色及病理计量分析。 结果 与假手术组比较，模型组骨量及子宫指数、肾上腺指数、垂体指数均显著降低（P < 0.05或P < 0.01），子宫内膜及宫壁厚度、内膜/宫壁比值，肾上腺束状带、球状带及皮质厚度，垂体嗜碱性细胞计数均显著降低（P < 0.05或P < 0.01）。与模型组比较，淫羊藿组、女贞子组及配伍组能显著增加骨量，子宫内膜及宫壁厚度、内膜/宫壁比值，肾上腺束状带、球状带及皮质厚度，垂体嗜碱性细胞计数（P < 0.05或P < 0.01）;配伍组可显著增加肾上腺指数（P < 0.05）;配伍组与淫羊藿组能显著增加垂体指数（P < 0.01）。 结论 淫羊藿、女贞子单用及配伍防治绝经后骨质疏松症大鼠骨质疏松的作用可能与改善内分泌器官的功能有关。

[关键词] 绝经后骨质疏松症;淫羊藿;女贞子;子宫;垂体;肾上腺

[中图分类号] R681 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）12（b）-0012-05

Abstract] Objective To research the effects of Epimedii Folium， Ligustri Lucidi Fructus and synergy of the two herbs on bone mass and endocrine organs in postmenopausal osteoporosis rats. Methods Forty-eight female SD rats of SPF level were divided into sham group， model group， Epimedii Folium group， Ligustri Lucidi Fructus group， synergy of Epimedii Folium and Ligustri Lucidi Fructus group （synergy group） and Raloxifene group （positive drug group） by random number table method. Except for sham group， the other groups were taken bilateral oophorectomy， and all rats were administrated with the corresponding medicines from postoperative 1 week to postoperative 12 weeks. The bone mass of right femurs was detected， and the uterus， adrenal gland and pituitary were collected to take hematoxylin-eosin staining and pathometriometric analysis. Results Compared with sham group， the bone mass， the uterus index， adrenal index and pituitary index in the model group were decreased significantly （P < 0.05 or P < 0.01）， the endometrial thickness， uterine wall thickness， and the ratio of endometrial thickness to uterine wall thickness， the thickness of adrenal zona fasciculate， zona glomerulosa and cortex， and the number of basophil cells of pituitary in the model group were decreased significantly （P < 0.05 or P < 0.01）. Compared with the model group， Epimedii Folium group， Ligustri Lucidi Fructus group and synergy group could significantly increase the bone mass， endometrial thickness， uterine wall thickness， and the ratio of endometrial thickness to uterine wall thickness， the thickness of adrenal zona fasciculate， zona glomerulosa and cortex and the number of basophil cells of pituitary （P < 0.05 or P < 0.01）; synergy group could ignificantly increase adrenal index （P < 0.05）; synergy group and Epimedii Folium group could significantly increase pituitary index （P < 0.01）. Conclusion The effects of Epimedii Folium， Ligustri Lucidi Fructus and synergy of the two herbs in prevention and treatment of osteoporosis in rats with postmenopausal osteoporosis may be related to the improvement of the function of the endocrine organs.

[Key words] Postmenopausal osteoporosis; Epimedii Folium; Ligustri Lucidi Fructus; Uterus; Pituitary; Adrenal gland

绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是绝经后妇女的常见病及多发病，主要因卵巢功能减退、雌激素水平下降，导致骨生成和骨吸收的代谢失衡。据有关资料显示，全国骨质疏松症患者已近7000万人，PMOP约占80%，而且随着人口不断的老龄化，其患病率还将进一步上升[1]。大量研究表明，中医药防治PMOP具有独特的优势，其中淫羊藿、女贞子是临床常用的治疗PMOP的补肾中药。课题组前期研究提示，以“阴阳双补，益精壮骨”立法的淫羊藿、女贞子配伍对糖皮质激素诱导的低转化性骨质疏松症及维甲酸诱导的高转化性骨质疏松症均有较好的防治作用[2-4]，并且能提高性激素水平[5]。前期研究结果为淫羊藿女贞子配伍改善PMOP的研究提供了实验基础。本研究采用双侧去卵巢手术诱导大鼠PMOP模型，通过观察淫羊藿、女贞子配伍及单用对骨量及内分泌器官包括子宫、肾上腺及垂体的病理组织学的影响，探讨药物防治PMOP的作用与改善内分泌功能的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康雌性SD大鼠，8月龄，体重（390±10）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2012-0001，动物伦理号：AEEI-2016-178。SPF级动物环境饲养，自由饮水、摄食。

1.2 仪器与药物

中药材淫羊藿、女贞子购自北京同仁堂药店;盐酸雷洛昔芬片购自LILLY，SA（西班牙，C614454）;注射用青霉素钠购自华北制药股份有限公司（F6082102）。尼康（Nikon）ECLIPSE 80i生物显微镜及NIS-Elements BR 3.2图像分析软件购自北京锐驰恒业仪器科技有限公司。

1.3 中药材煎煮方法

分别称取适量淫羊藿饮片、女贞子饮片及淫羊藿女贞子饮片（4∶3），首煎加8倍体积的水浸泡1 h后加热煮沸，文火保持沸腾30 min，搅拌、趁热滤取药液;药渣再加原药量6倍的水加热煮沸，改文火续煎30 min后过滤，合并2次药液，浓缩至含生药0.35 g/mL，4℃保存。

1.4 造模方法

参考文献[6]，行双侧卵巢切除术造模（术前8 h禁食）。在无菌条件下各组大鼠均用1%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔内注射麻醉，取腹腔正中切口。除假手术组外，各组大鼠均行双侧卵巢摘除术，然后缝合腹部;假手术组用同样手术方法暴露卵巢，切除少量脂肪，不摘除卵巢。术后每只大鼠给予青霉素钠盐20万U/d肌注，连续3 d。以子宫萎缩及骨量明显降低为造模成功的标准。

1.5 实验动物分组与给药

按照随机数字表法将动物分成六组，每组8只，包括假手术组、模型组、淫羊藿组、女贞子组、淫羊藿女贞子配伍組（配伍组）、雷洛昔芬组（阳性药组）。术后1周开始灌胃给药，淫羊藿组、女贞子组及配伍组的给药量均为7.0 g/kg体重，阳性药组的用药量为6.25 mg/kg体重。每日1次，共计给药12周。

1.6 观察指标

大鼠腹腔麻醉处死。取右侧股骨称湿重、测量体积后，将股骨置烤箱内110℃加热24 h，称干重;后放入600℃马弗炉内加热3 h，冷却后称灰重。摘取肾上腺、子宫、垂体称重，右侧肾上腺、子宫、垂体固定于4%多聚甲醛溶液内，后行HE染色，子宫切片100倍光镜下行病理计量学分析，肾上腺及垂体切片在400倍光镜下行病理计量学分析。子宫的病理参数为宫壁厚度、内膜厚度及内膜/宫壁[7];肾上腺的病理参数包括球状带、束状带、网状带及皮质总厚度[8];垂体的病理参数是垂体内嗜碱性细胞数[9]。

1.7 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较根据方差齐性检验结果选择LSD（方差齐）或Tamhane′s T2（方差不齐）检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 淫羊藿、女贞子对绝经后骨质疏松症大鼠骨量的影响

与假手术组比较，模型组相对骨量，包括湿重/体积、干重/体积、灰重/体积均显著降低（P < 0.05或P < 0.01）。与模型组比较，4个给药组均能明显升高湿重/体积与灰重/体积（P < 0.05或P < 0.01）;淫羊藿组、女贞子组及配伍组均能显著升高干重/体积（P < 0.05）。见表1。

2.2 淫羊藿、女贞子对绝经后骨质疏松症大鼠子宫的影响

与假手术组比较，模型组子宫指数显著降低（P < 0.01），子宫HE染色的病理参数分析结果显示，模型组子宫内膜及整个宫壁的厚度、内膜与宫壁厚度的比值均较假手术组显著降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。与模型组比较，各给药组对子宫指数无显著影响（均P > 0.05），但能显著增加内膜、宫壁厚度及内膜与宫壁厚度的比值（P < 0.05或P < 0.01）。此外，配伍组较淫羊藿组能显著增加子宫内膜厚度及内膜与宫壁厚度的比值（P < 0.05或P < 0.01）。见表2。

2.3 淫羊藿、女贞子对绝经后骨质疏松症大鼠肾上腺的影响

与假手术组比较，模型组肾上腺指数显著降低（P < 0.01）;肾上腺病理参数分析结果显示，模型组肾上腺皮质总厚度、束状带及网状带厚度较假手术组明显降低（P < 0.05）。与模型组比较，配伍组肾上腺指数显著增高（P < 0.05）;淫羊藿组、女贞子组及配伍组均能显著增加肾上腺皮质总厚度、束状带及网状带厚度（P < 0.05或P < 0.01）。见表3。

2.4 淫羊藿、女贞子对绝经后骨质疏松症大鼠垂体的影响

与假手术组比较，模型组垂体重量及指数均显著降低（P < 0.01）;垂体HE染色后嗜碱性细胞数亦显著下降（P < 0.01）。与模型组比较，淫羊藿组、配伍组及阳性药组垂体重量及指数均显著上升（P < 0.05或P < 0.01）;4个给药组嗜碱性细胞数显著上升（P < 0.05或P < 0.01）。见表4。

3 讨论

PMOP的骨代谢失衡与雌激素水平降低导致的内分泌功能紊乱与衰老密切相关，子宫、垂体、肾上腺功能失调会影响雌激素的合成及骨代谢水平。文献报道，在绝经期妇女及去卵巢手术后的大鼠中，子宫逐渐萎缩[10]。为评价去卵巢手术是否成功，本研究观察了子宫指数及子宫的病理改变。与假手术组比较，模型组出现子宫显著萎缩现象，表现为子宫指数减轻，子宫的内膜、宫壁厚度及内膜/宫壁厚度比值均显著降低。淫羊藿、女贞子单用及配伍使用均可显著改善子宫内膜、宫壁厚度及内膜/宫壁厚度的比值，提示其有一定的预防子宫萎缩的作用。此外，淫羊藿、女贞子配伍的改善作用优于淫羊藿单用，提示配伍组方中补阴药女贞子对子宫萎缩的改善作用较好及配伍作用的优势。

除卵巢外，肾上腺是合成雌激素的重要内分泌器官[10]。Venkatesh等[11]报道，去卵巢大鼠术后肾上腺重量显著降低。为进一步评价雌激素缺乏对内分泌器官的影响，本研究计算了肾上腺指数并分析了肾上腺HE染色后肾上腺皮质各层的厚度，研究结果显示，模型组大鼠肾上腺指数及肾上腺束状带、网状带及整个皮质厚度均显著降低，提示肾上腺处于萎缩状态且肾上腺的内分泌功能减退，性激素合成亦显著减少。淫羊藿、女贞子单用及配伍使用后，均可以显著改善肾上腺的病理参数值，但仅配伍组可以显著增加肾上腺指数，提示淫羊藿、女贞子单用及配伍均可改善肾上腺的内分泌功能，配伍后还能预防肾上腺的萎缩。

雌激素是脑垂体细胞功能的主要调节因子之一，去卵巢大鼠可导致脑垂体细胞凋亡[12]。嗜碱性细胞是垂体中分泌促甲状腺激素、促肾上腺皮质激素和促性腺激素的一类内分泌细胞，主要影响雌激素的合成与骨骼的发展[13]。本研究发现，大鼠垂体指数及垂体中嗜碱性细胞数在去卵巢手术后均显著降低，提示术后垂体功能减退。给予淫羊藿、女贞子单用及配伍治疗后，垂体中嗜碱性细胞数均显著升高;淫羊藿组及配伍组可以显著改善垂体指数，提示淫羊藿、女贞子单用及配伍能改善垂体的内分泌功能。此外，淫羊藿单用、淫羊藿女贞子配伍有一定的预防垂体萎缩的作用。

淫羊藿、女贞子分别为补肾阳、补肾阴药，是中医药防治更年期综合征及PMOP的常用药物[14-15]。二者合用，有平补阴阳、益肾健骨的功效，是首都国医名师李世增教授临床常用于防治骨质疏松症的基本方。现代研究证实，淫羊藿及女贞子均有雌激素样作用[16-18]，同时对骨质疏松症大鼠具有多种保护作用。淫羊藿及其有效成分可有效纠正骨代谢异常，降低骨转换率，增加骨密度，改善骨組织病理状态，促进实验性骨质疏松性骨折修复，从而发挥抗骨质疏松作用[19-21]。女贞子可显著抑制过高的骨转换率，提高钙吸收，减少钙排放，维持体内钙稳态[22-23]。本研究以去卵巢导致的PMOP大鼠模型进行研究，发现淫羊藿（7 g/kg）、女贞子（7 g/kg）、淫羊藿女贞子配伍（淫羊藿4 g/kg合女贞子3 g/kg）对骨量的下降，包括干重/体积、灰重/体积、湿重/体积均有改善作用，且均能增加子宫内膜及宫壁厚度，肾上腺束状带、网状带及皮质厚度，垂体嗜碱性细胞数，提示对骨量的改善作用可能与调节内分泌脏器的功能有关。虽然配伍组中淫羊藿、女贞子的用量较单用少，但对子宫内膜厚度的改善作用显著优于淫羊藿单用，且具有女贞子单用所不具有的对垂体指数的增加作用，提示配伍用均较单用更具优势。

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（收稿日期：2018-04-28 本文编辑：张瑜杰）