槐耳醇提取物通过抑制胃癌细胞周期影响胃癌增殖的研究

倪益秀 胡灿 孔炫栋 王晓峰 徐志远 程向东⋆

胃癌是我国常见恶性肿瘤之一，对人民的健康构成巨大威胁，在临床上有多种有效的治疗方案［1-3］。根治性手术是最有效的治疗手段，但患者术后易复发［4-5］。近年来，中医中药类在胃癌患者的治疗中发挥着越来越重要的作用，尤其是对中晚期胃癌的患者。槐耳是一种中药，自从发现其有抗肿瘤作用以来，作为癌症治疗的补充疗法，在中国已被广泛使用［6］。而槐耳醇提取物是近几年出现的将中药槐耳提纯至较高纯度的制剂［7-8］，与传统水提取物相比，其不仅药用纯度更高，而且毒性低。槐耳醇提取物作为一种新兴的中药提取物，已有相关实验证明其胃癌细胞有一定的杀伤作用。本实验的目的是为了探究槐耳醇提取物对胃癌细胞增殖抑制作用的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）实验动物：裸鼠（BALB/c-nu，浙江中医药大学动物中心提供），雌性20只，鼠龄3～5周。（2）实验药品：槐耳醇提取物（浙江省中医院中心实验室提供）制成100mg/ml的二甲基亚砜（DMSO）溶液。（3）主要试剂：RPMI Medium Modified 1640（美国HyClone公司）；胎牛血清FBS（Gibco）；胰蛋白酶-EDTA消化液（北京索莱宝科技有限公司）；Cell Counting Kit-8（杭州诺扬生物有限公司）；Phosphate Buffered Saline（美国HyCloneTM公司）；膜联蛋白V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（San Diego，CA，USA）；DMSO（美国Amresco公司）。（4）主要仪器：倒置荧光显微镜（日本OLYM-PUS公司，IX71）；多功能全波长酶标仪（Thermo）；CO2恒温培养箱（Thermo，型号3111）；生物安全柜（Thermo，型号1287）；台式冷冻多用离心 机（Thermo，型 号CL31R）。（5）细 胞 株：AGS、HGC-27、MGC-803细胞株（浙江省中医院中心实验室提供）。

1.2 实验方法 （1）细胞培养：用体积分数为10%的胎牛血清RPMI-1640培养液，在37℃、5%的CO2培养箱中培养，细胞呈贴壁生长，取对数生长期细胞用于实验。（2）测定不同浓度槐耳醇提取物对胃癌细胞的增殖抑制作用：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度为5×104/ml，接种于96孔板，每孔加入100μl，37℃、5%的培养箱中孵育24h至细胞单层铺满孔底。分别加入终浓度为1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.0625μg/ml和0μg/ml的槐耳醇提取物样品溶液，每个浓度设3个复孔，同时设1个平行空白对照孔，阴性对照组加不含药物的RPMI-1640培养液，培养24h后，用细胞计数试剂盒-8测试细胞活力。将10μl的CCK-8溶液加入至每个孔中，随后将96孔板在37℃下温育1h或2h。在450nm波长处检测OD值以确定酶标仪（Thermo）上的细胞活力。该测定进行≥3次。如下计算细胞活力：抑制率=（OD对照-OD实验）/（OD对照-OD空白）×100%。（3）划痕实验：将胃癌细胞AGS和MGC-803分别接种于Ibidi公司的插件中，每孔接种1.0×107个细胞，培养24h后，拔除插件，用PBS清洗2遍，加入无血清RPMI-1640溶液，分别观察并拍摄0h、4h、8h、12h、24h、32h的迁移情况。

1.3 流式细胞术测细胞周期和细胞凋亡 在确定细胞凋亡之前，将MGC-803细胞预处理，然后与PBS，0.1、0.2、0.3mg/ml的槐耳醇提取物一起温育48h。随后，收集附着细胞和漂浮细胞并使用膜联蛋白V-FITC/PI染色试剂盒（BD Biosciences）分析。细胞用冷PBS洗涤，重悬于结合缓冲液中，并用膜联蛋白V-FITC染色10min，并在黑暗中PI染色5min。用荧光激活细胞分选（FACS）流式细胞仪（BD Biosciences）定量凋亡细胞。

1.4 蛋白质印迹实验 温育后，收获使用PBS、槐耳清膏、槐耳醇提取物处理的细胞并裂解。对于蛋白质印迹分析，使用BCA蛋白质测定试剂盒定量的等量蛋白质进行10%SDS-PAGE，然后在硝酸纤维素膜上进行免疫印迹，然后在室温下封闭5%脱脂牛奶2h，然后与指定的一抗（1：1000用于CyclinD1，肌动蛋白）在封闭溶液中于4℃孵育过夜。然后使印迹与HRP缀合的二抗反应，并使用ECL系统使用GAPDH水平作为对照来定量信号。

1.5 动物实验 使用皮下接种法，在MGC-803细胞数目和细胞活性达到接种水平后，将细胞进行离心，用无血清1640进行稀释，制成均匀的细胞悬浊液（1.0×107/ml）备用。将细胞悬浊液接种于5只小鼠右侧腋窝皮肤，每只0.2ml。观察接种小鼠成瘤情况，喂养2周见肿瘤长出后，取瘤体较大的肿块，切成均匀的10mm3左右瘤块，种植到小鼠右侧腋下，使用PBS稀释成0.5mg/kg的槐耳清膏和槐耳醇提取物灌胃。每2天测量裸鼠瘤体直径大小。喂养1个月后处死，取出完整瘤体，比较各组肿瘤大小。

1.6 统计学方法 采用SPSS 23.0统计软件。计量资料的多组间比较采用单因素方差分析，方差齐性采用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 槐耳醇提物作用后各组细胞活力比较 细胞实验中槐耳醇提取物对胃癌细胞AGS、MGC-803具有增殖抑制作用，其抑制率随着槐耳醇提取物浓度的增加而增加。其对胃癌细胞AGS、MGC-803的半抑制浓度（IC50）分别为0.1112mg/ml、0.2213mg/ml。

2.2 槐耳醇提物对胃癌细胞AGS和HGC-27迁移能力的影响 使用0.05mg/ml的槐耳醇提取物作用胃癌细胞AGS和HGC-27细胞可以发现，与空白对照组比较，随着药物作用时间的延长，划痕愈合的速度变慢。在药物作用32h时，与正常对照组相比，迁移面积缩小最为明显，其次是24h时。说明槐耳醇提取物能在体外抑制AGS（图1、2）和HGC-27胃癌细胞的迁移能力（图3、4）。

图1 AGS细胞迁移能力图

2.3 流式细胞术分析结果 从流式细胞术图中可以看出，用PBS或0.1、0.2、0.3mg/ml的槐耳醇提取物处理48h后，图3A仅出现约6.5%凋亡细胞，随后暴露于0.1、0.2、0.3mg/ml的槐耳醇提取物MGC-803细胞中，整个细胞中出现的凋亡细胞死亡量分别为45.3、55.6和66.8%（见图5），证明槐耳醇提取物处理后MGC-803细胞发生凋亡。

2.4 Western blot检 测 各 组CyclinD1表 达 结果 Western blot检测用0.05mg/ml的槐耳清膏和槐耳醇提取物分别作用胃癌细胞MGC-803 48h后，使用槐耳组的细胞周期蛋白CyclinD1与空白对照组相比明显降低，而相同浓度的槐耳醇提取物较槐耳清膏具有更强的增殖抑制作用。

2.5 荷瘤小鼠肿瘤抑制情况 在动物实验中，观察使用PBS、5mg/ml槐耳清膏、5mg/ml槐耳醇提取物对荷瘤小鼠皮下肿瘤的作用，发现其抑制作用十分明显（P＜0.05），见图6。

图2 AGS细胞迁移相对愈合面积比

图3 HGC-27细胞迁移能力图

图4 HGC-27细胞迁移相对愈合面积比

图5 流式细胞术测MGC-803凋亡图

3 讨论

槐耳为多孔菌科栓菌属真菌槐栓菌的子实体，过去的研究通常使用槐耳水提取物槐耳清膏，其能治疗多种恶性肿瘤，在结肠癌、肝癌、胃癌等均有一定的作用。而槐耳醇提取物的成分较水提取物更为清晰，有研究表明，槐耳正丁醇部位具有显著的杀伤肿瘤细胞的作用。本研究证明，槐耳醇提取物部分具有与槐耳水提取物及其多糖成分相同的抗肿瘤作用，不论是在细胞实验还是体外动物模型试验中槐耳醇提取物均有显著抑制胃癌细胞增殖的作用，在CCK-8和荷瘤小鼠实验中，使用相同浓度的槐耳醇提取物和槐耳水提取物时，槐耳醇提取物的胃癌细胞增殖抑制作用效率都高于槐耳水提取物。从Western blot实验结果中可以看出，使用槐耳醇提取物组的CyclinD1蛋白明显增加，说明胃癌细胞在G1期阻滞，其机制胃癌细胞增殖可能与抑制细胞周期G1期有密切的关联，可证明槐耳醇提取物的药用成分是有价值的，并且药用价值不低于其水提取物，且槐耳醇提取物的心脏毒性和肝肾毒性都较传统的水提取物低。然而槐耳醇提取物的药物成分和其药理作用还有待进一步研究，其在临床中使用还需进一步探究。

图6 1个月时小鼠肿瘤组织的生长情况