九江市2013～2017年新生儿高苯丙氨酸血症筛查及基因分析

唐军 谢晓翔 倪龙凤 陈衍娇

[摘要]目的 探讨九江市新生儿高苯丙氨酸血症（HPA）的患病率及临床分型、基因突变特点。方法 选取本市2013年1月～2017年12月出生的新生儿共261 659例作为筛查对象，使用芬兰产VICTOR-2D全自动免疫荧光仪对处理后的血斑标本进行检测；对确诊HPA患儿行四氢生物蝶呤（BH4）负荷试验、尿蝶呤谱分析和红细胞二氢蝶啶还原酶（DHPR）活性测定以鉴别诊断，以Sanger测序对苯丙氨酸羟化酶（PAH）基因突变进行分析。结果 筛查261 659例活产新生儿后发现HPA 24例，患病率1/10 902。24例HPA中，14例（58.3%）苯丙氨酸羟化酶（PAH）缺乏症（PKU），患病率1/18 689，其中7例（50%）经典型苯丙酮尿症（PKU），2例（14.3%）轻度缺乏PKU，5例（35.7%）BH4缺乏症，11例患儿接受PAH基因突变分析，其中，9例发现2个突变点，2例发现1个突变点，共发现12种基因突变。结论 九江市PAH缺乏症发病率低于全国水平，以经典PKU和BH4为主，早期新生儿HPA筛查有利于降低全市出生人口缺陷率。

[关键词]新生儿；高苯丙氨酸血症；基因；苯丙氨酸羟化酶缺乏症

[中图分类号] R725.9 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）12（b）-0068-03

[Abstract] Objective To explore the prevalence rate， clinical typing and gene mutation characteristics of neonatal hyperphenylalanine syndrome （HPA）in Jiujiang City. Methods A total of 261 659 newborns from January 2013 to December 2017 were selected as screening objects. For the diagnosis of hyperphenylalanine， tetrahydrobiological pterine stress test， urine pterine spectrum analysis and erythrocyte dihydropteridine reductase activity were performed， and phenylalanine hydroxylase gene mutation was analyzed by Sanger sequencing. Results After screening 261 659 live newborns， 24 cases of HPA were found， and the prevalence rate was 1/10 902. Among 24 cases of high blood phenylalanine， 14 cases （58.3%） was phenylalanine hydroxylase deficiency（PKU）， the prevalence of 1/18 689， including 7 cases （50.0%） with typical benzene acetone urine disease （PKU）， 2 cases（（14.3%） with lack of mild PKU， 5 cases（35.7%） of BH4 deficiency. 11 patients received PAH gene mutation analysis， 9 cases were found with two point mutations， 2 cases with a mutation point. A total of 12 kinds of genetic mutations was found. Conclusion The incidence of phenylalanine hydroxylase deficiency in Jiujiang City is lower than the national level， mainly including classic PKU and BH4. Screening for early neonatal HPA is conducive to reducing the rate of birth defects in the city.

[Key words] Newborn babies； Hyperphenylalanine； Genes； Phenylalanine hydroxylase deficiency

苯丙酮尿癥（PKU）属于常染色体隐性遗传疾病，属于罕见病，仅影响15 000人中约1人。例如，在美国，每年约有275例婴儿患有该疾病[1-2]。由于编码苯丙氨酸羟化酶（PAH）的基因中有800多个突变。不同严重程度的突变可引起可变的PAH损伤，导致从轻度高苯丙氨酸血症（HPA）到经典的HPA，对苯丙氨酸饮食耐受能力也各不相同[3]。如果在新生儿期检测到这种情况并开始专门的饮食，则可以避免由PKU引起的严重认知障碍。然而，为了使饮食治疗有效，必须在生命的最初几周内，在成千上万的其他未受影响的婴儿中识别出具有PKU的婴儿。在我国，2016年PKU的发病率约为1/15 363，PAH基因突变在普通人群的携带率为1/35[4]。我国于1981年开始进行HPA的筛查与治研究，江西九江地区从2013年开展此项工作。本研究旨在对九江地区HPA的患病率、临床分型进行分析研究。

1资料与方法

1.1一般资料

选取本市2013年1月～2017年12月新生儿261 659例活产新生儿的血苯丙氨酸初筛数据。充分哺乳的出生3～7 d新生儿经知情告知同意后，接产医院根据《新生儿疾病筛查血片采集技术规范》[5]中要求采足跟血。采血时间均不超过出生后20 d。所有样本的采集和检测均经九江市妇幼保健院医学伦理委员会批准并在监护人签署知情同意书的情况下完成。

1.2研究方法

使用芬兰PE公司提供的苯丙氨酸测定试剂盒（茚三酮荧光法）进行检测。具体操作如下。①使用打孔器将血斑标本依次打入板孔中。②使用移液器在每孔中加15 μl 萃取液，室温慢速振荡2 h，放入2～8℃冰箱孵育18～22 h。③每孔加入40 μl去离子水，室温慢速振荡20 min，每孔取25 μl转移至反应板，并加入50 μl茚三酮试剂，37℃孵育120～140 min。④孵育结束后每孔加入200 μl铜试剂慢速振荡5 min，室温放置3 h后上机检测。

1.3结果判断

对血斑标本进行处理后，使用配套仪器1420 Victor 2D多标记荧光分析仪对样本进行检测，以检测值>阳性切值2 mg/dl视为初筛阳性；对初筛阳性标本行重新采血复查，结果仍>2 mg/dl视为筛查阳性，并进行鉴别诊断，包括串联质谱、尿蝶呤谱分析、红细胞二氢蝶呤还原酶活性测定、四氢生物蝶呤（BH4）负荷实验、基因检测（对PAH基因外显子1-13编码区及前后10 bp的剪切区分别进行PCR扩增并Sanger测序）。

1.4基因突变检测

根据新生儿疾病筛查技术规范（原卫生部2010年版）进行分型，新生儿血苯丙氨酸浓度持续>2.0 mg/dl为HPA。排除BH4缺乏症后，苯丙氨酸浓度>6.0 mg/dl为经典型PKU，血苯丙氨酸≤6.0 mg/dl为轻度PKU。BH4缺乏症最常见为6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶（PTPs）缺乏症，其次为二氢蝶呤还原酶（DHPR）缺乏症。

1.5统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，对血苯丙氨酸控制浓度与智能发育水平的关系采用Bivariate法进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1筛查人数及阳性病例情况

从2013年1月～2017年12月，我院筛查中心共筛出生的新生儿261 659例，其中HPA 24例，患病率为1/10 902。24例检出的HPA中，14例（58.3%）为苯丙氨酸羟化酶缺乏症（PAH），患病率1/18 689，其中7例（50%）经典型PKU，2例（14.3%）轻度缺乏PKU，5例（35.7%）BH4缺乏症。2013～2017年，九江市PKU筛查阳性率分别为1/14 286（2013）、1/10 429（2014）、1/7454（2015）、1/11 447（2016）、1/14 309（2017）、合计1/10 902。

2.2 11例PHA基因突变情况分析

遵家属意愿，有11例患儿入组进行后续研究，在这11例PKU患儿中，5例（42.9%）为经典型PKU，2例（14.3%）为轻度缺乏，4例（14.29%）为BH4缺乏症。基因突变分析发现，PKU患儿检出错义突变、无义突变、剪接突变及纯合突变4种类型，共发现12种基因突变，其中PKU和HPA患儿基因突变包括E2 c.158G>A、E4 c.395C>T、E6 c.611A>G、E6 C.563delG、E7 c.728G>A、E8 c.907delT、E11 c.1197A>T、E12 c.1222C>T、I4 c.442-1G>A，BH4患儿则检出3种基因突变E5 c.259C>T、IVS1 c.84-291A>G、IVS3 c.186+1G>A。

3讨论

苯丙氨酸是人体必需氨基酸之一，其主要在肝臟内PAH的作用下转化成酪氨酸。该途径由于某种原因受阻或发生障碍，会导致苯丙氨酸在体内异常蓄积，引发HPA，过多的苯丙氨酸经转氨基生成苯丙酮酸等其他代谢产物经尿排出，即PKU[6]。1934年，Folling医生首次诊断报道了PKU，1961年美国Guthrie医生建立了PKU的筛查方法即细菌抑制法，使PKU的新生儿筛查得以实现[7-8]。我国从1981年开始在全国逐步推广新生儿筛查。九江市于2013年开始PKU的筛查，每年定期进行全市采血点质量控制检查和培训。本研究主要对2013年以来的新生儿进行筛查，了解九江市新生儿HPA的患病率及临床分型、基因突变特点。

PKU是一种常染色体隐性遗传病，是常见的先天性氨基酸代谢异常疾病，但发病率因种族及地区有明显差异，总发病率为1∶500～1∶10 000[9]。据报道，2016年全国新生儿筛查HPA的发率为1/15 363，且北方发病率高于南方。本研究从出生的261 659例新生儿筛查数据发现，HPA24例，其中PKU发病率1/18 689，比例低于全国平均水平，这可能与九江市人口较少，人口结构比较单一且人口流动性不大有关。

根据血浆中苯丙氨酸浓度可将PAH缺乏型HPA分为三型[10]：即经典型PKU（≥1200 μmol/L），中等型HPA（360～1200 μmol/L），轻型HPA（120～360 μmol/L），其中经典型PKU患者病情最重。国内外研究大多数以经典型PKU为主，较少纳入轻度HPA[11-14]。本研究发现HPA24例中，14例（58.3%）PAH，患病率1/18 689，其中7例（50%）PKU，2例（14.3%）轻度缺乏，5例（35.7%）BH4缺乏症。本研究群体经典型PKU占50%，轻度PKU和BH4缺乏症分别为14.3%和35.7%。并且不同表型组的突变检出率不同，与舒剑波等[15]的报道一致；本研究中，11例接受基因检测分析患儿中PKU患儿检出错义突变、无义突变、剪接突变及纯合突变4种类型，共发现12种基因突变，PKU患儿检出9种占75%；BH4患儿检出3种基因突变，占25%，共计12种突变，不过由于检测基数不大，可能存在数据的片面性，还需要观察积累更多的数据。

综上所述，通过新生儿HPA筛查结果分析可以反映九江市PKU的发病率及基因型特点，九江市PAH发病率低于全国水平，以经典PKU和BH4缺乏症为主。全面积极地开展新生儿疾病筛查对HPA的早发现、早治疗至关重要，有利于降低全市出生人口缺陷率，并且随着新生儿疾病筛查覆盖率的扩大，确定患儿的基因型将有助于临床医师对不同患者实施个体化治疗方案，为遗传咨询提供帮助。

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