应用分子生物学技术鉴定体液斑迹组织来源的研究进展

孙启凡，李冉冉,2，胡 胜，李彩霞，叶 健，季安全,*

（1. 公安部物证鉴定中心，现场物证溯源技术国家工程实验室，法医遗传学公安部重点实验室，北京 100038；2. 山西医科大学, 太原 030001）

法医遗传学对于生物物证的分析主要以DNA检验为基础，利用DNA的遗传稳定性，通过对STR、SNP等遗传标记的检测，实现个体识别、个体信息推断、个体间亲缘关系分析等目标要求[1]。但由于DNA还具备同一性的特点，仅做序列分析无法区分其不同组织和器官来源。然而对于人源性样本，如现场血迹、外周血或是月经血、喷溅血或是鼻血，对于案件定性或重建案发现场很有价值。且其不同的组织属性作为证据的效力也不相同，而法庭也经常要求出具确认斑迹的科学证据。对生物证据科学、详尽的描述，可有效避免证据采信过程中由于误解或歧义而引发的纠纷甚至群体性案（事）件。这就要求对现场DNA来自于何种组织能够进行准确判定。实际上，法医学组织/体液鉴定不是一个新鲜的概念，传统鉴定的方法相对较多，如基于酶促反应或免疫学检测的生化鉴定、光谱学鉴定等。但这些方法一是特异性较低，二是检材需求量大或者会破坏检材，三是只能针对简单检材，四是对操作者的经验要求较高，主观性强，结果准确度难以保证[2]。

分子生物学基础理论及检验技术的发展，为解决组织来源鉴定问题提供了新手段，现已有应用，虽准确性有待进一步提高，但其在法庭科学的普遍推广应予可期。

1 不同生物组织属性来源区分的分子基础

目前，法医学对组织来源鉴定所使用的分子标志主要有信使RNA（messenger RNA，mRNA）、微RNA（MicroRNA，miRNA）、DNA甲基化及微生物菌群四种，之所以会选择这些作为研究对象，与其各自生物学基础密切相关。每个成年个体大约包含210种功能各异的细胞类型[3]，但是除了生殖细胞（精子，卵细胞）以及无核细胞（血小板、红细胞）外，所有的体细胞均拥有相同的二倍体基因组，这也是法医DNA分型技术的理论基础。在胚胎发育和分化过程中，细胞的功能分化在基因组水平上是高度调控的：DNA首先转录成RNA，RNA再翻译成蛋白质，此构成为生命体遗传物质发挥功能的中心法则。而基因表达是有时空差异的。具体来讲，每一个特异的细胞类型仅表达人类基因组22000个编码基因的子集，而相应的mRNA便是这个特定子集被表达的决定因素。人类mRNA的存活周期很短，平均大约10 h，这使得细胞必须迅速改变蛋白质的合成，以适应不断变化的需求[4]。生命体内大约只有2 %的基因组被翻译成蛋白质，但可转录成RNA的则高达85 %[5]。

一些调控性RNA如MicroRNA或能对细胞的分化起到关键作用[6]。MicroRNA是一类内源性的非编码小分子RNA，广泛存在于各种真核细胞中。目前，人类共发现并确定了1800多种MicroRNA[7]。在哺乳动物体内，MicroRNAs主要通过抑制靶mRNA的翻译或直接剪切靶mRNA而广泛参与调节细胞的生长发育、分化、凋亡、衰老、疾病及肿瘤发生等众多生命活动[8]。MicroRNA的表达具有高度的组织特异性[9]。除了mRNA以及MicroRNA的区别，不同类型细胞在表观遗传上也具有明显的差异性。表观基因组包括DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质结构差异等。但在提取的DNA中，只有甲基化可被保留，这使得DNA甲基化可成为法庭科学应用的一种表观遗传学类型。DNA甲基化在胚胎发育、转录、染色体结构稳定性等方面具有重要作用[10]。甲基化谱有时空特异性、细胞特异性和亲源特异性，这为甲基化标记应用到法医体液鉴定提供了理论依据[11]。

一个成年人个体大约有40万亿个细胞，除此以外，还存在有大约10倍以上的微生物菌群[7]。人类微生物组计划已对人类微生物进行了系统的研究[12-14]，人类微生物广泛存在于人类体内，如皮肤、嘴巴、肠道、阴道等部位，能行使辅助消化或维持相关器官的健康等作用，不同的身体部位微生物群落是不一样的[15]，这就为研究人类微生物群落从而推断人体不同组织属性提供了理论基础。

2 分子生物学技术推断生物物证组织属性的研究进展

2.1 mRNA是生物物证组织属性推断技术研究中使用最成熟的分子标记物

mRNA是生物物证组织属性推断技术研究中使用最成熟的分子标记物，已有外周血、月经血、唾液、阴道分泌物等多种体液组织的特异性mRNA被提取并验证。自2011年开始，欧洲DNA分型组织结合已有研究成果，先后5次组织了实验室间的联合测试以考察mRNA在组织来源推断中的能力与可行性。第一次共有16家实验室参加，主要针对三种血液特异性的mRNA：血红蛋白-βHBB、红细胞血影蛋白-βSPTB以及胆色素原脱氨酶PBGD，结果发现15家实验室均可从提供的血液斑中成功检测到这三种mRNA[16]。第二次仍然是针对血液的特异性mRNA，不过其中mRNA被分成了两组，分别是高度敏感型血红蛋白-αHBA、HBB，中度敏感性5-氨基酮戊酸合成酶2 ALAS2, TCR-CD3分子复合物CD3G，红细胞锚蛋白1 ANK1、 PBGD和红细胞血影蛋白-β SPTB，这次提供的样品包括了陈旧检材（室温下放置三年的棉签血）[17]。第三次测试主要针对唾液特异性mRNA（富组蛋白3 HTN3，富络蛋白STATH和粘蛋白7 MUC7）以及精液特异性mRNA（磷酸丝氨酸转氨酶PSA、人鱼精蛋白2 PRM2、生精蛋白1 SEMG1、转谷氨酰胺酶4 TGM4和人鱼精蛋白1 PRM1）[18]。第四、五次测试[19]则是对7种月经血特异性mRNA（基质金属蛋白酶7 MMP7、基质金属蛋白酶10 MMP10、基质金属蛋白酶11 MMP11、MSH同源蛋白1 MSX1、左右决定因子2 LEFTY2、分泌型卷直相关蛋白4 SFRP4、Hs202072）、7种阴道分泌物特异性mRNA（肌肉特异性蛋白1 MYOZ1、细胞色素P450 2B 7P1 CYP2B7P1、粘蛋白4 MUC4、人β-防御素1HBD1、詹氏乳杆菌Ljen、卷曲乳杆菌Lcris、加式乳杆菌Lgas）以及3种管家mRNA（β2-微球蛋白B2M、泛素C UBC、泛素结合酶UCE）进行了特异性、灵敏度测试，除Hs202072检出率较低以外，其余16种均被证实可有效应用于法庭科学中。2015年，第六次测试[20]，除了针对DNA/RNA共提取以及mRNA与STR同时检测技术外，重点测试了接触类检材如人类皮肤、指掌纹、衣物、电子产品等物证材料，特异性mRNA包括三种角质化包膜1C LCE1C、1D LCE1D、2D LCE2D，白细胞介素1F7 IL1F7，趋化因子配体27 CCL27，兜甲蛋白LOR，角蛋白9 KRT9和角膜锁链蛋白CDSN，以及管家基因B2M、UBC和UCE。上述测试都证实了mRNA检测在组织来源鉴定中的可行性。

2.2 MicroRNA区分不同体液组织属性具有独特优势

考虑到mRNA容易降解等限制，许多实验室也在研究用MicroRNA进行此项工作。不同的实验室各自筛选了一些特异性的MicroRNA位点组合来区分各类体液。而随着分子检测技术的进步，MicroRNA筛选的技术手段也在不断更新。2009年，Hanson等[21]使用SYBR®Green qPCR技术从452个人类MicroRNA中检测出9个具有体液差异性表达的MicroRNA，2010年，Zubakov等[22]采用寡核苷酸芯片检测718个人类MicroRNA在法医常见体液中的表达水平，并用TaqManqPCR技术鉴定出9个体液标记MicroRNA；2011年，Courts等[23]利用Geniom®Biochips检测人类血液和唾液中MicroRNA的表达水平，后续的SYBRGreen-qPCR确认了6个标记MicroRNA，但并未检测其他法医常见体液；2016年，四川大学王正等对几个主要实验室的工作进行了整理[24]，综合报道了使用二代测序技术筛选到的9个血液特异性MicroRNA以及16个唾液特异性MicroRNA，并推荐了三种特异性好的MicroRNA(miR486、miR888与miR214)以及内参基因U6[25]。

2.3 DNA甲基化用于组织来源推断的可行性

在人类的遗传物质中，除了转录组即RNA层面具有组织特异性以外，表观遗传上不同组织也呈现出较大的不同，这包括DNA甲基化、乙酰化等，但是对于提取后的DNA，只有DNA甲基化仍可以被检测，因此，陆续有实验室利用DNA甲基化进行组织来源推断的研究[26]。前期的研究集中在部分基因位点上，确定了如DACT1、USP49、PRMT2和PFN3等精液特异性基因以及HOXA4等血液特异性基因[27-28]。因甲基化水平受年龄等因素影响较大，为排除其他干扰因素，Park等人使用测序芯片对血液、唾液、精液以及阴道分泌物4种体液的450000个CpG位点的甲基化水平进行了大规模筛选和验证，发现并确定了8个组织特异性甲基化位点，分别是血液特异性甲基化位点cg06379435、cg08792630，唾液特异性甲基化位点cg26107890、cg20691722，精液特异性甲基化位点cg23521140、cg17610929及阴道分泌物特异性甲基化位点cg14991487、cg01774894[29]。Muangsub等人进一步使用基因芯片技术将样本来源扩展到包括脑组织在内的22种常见人体组织，最终筛选获得86个组织特异性甲基化CpG位点[30]。2015年Matthew等人从基因组水平研究人类组织细胞的甲基化谱差异，除发现不同的组织特异性甲基化位点外，还展现了mCG和mCH的染色质修饰状态和人体大量组织的转录状况，提示mCH能通过作用于干细胞而抑制其向其他细胞类型分化[31]，为法医遗传学家利用DNA甲基化解决体液斑迹组织属性来源鉴定问题提供了很好的参考数据。

2.4 微生物法或为体液组织来源推断的有力工具

使用微生物法进行体液组织来源推断，其依据是不同的菌群只能特异性的存活于特定的某种或某些体液组织中。如链球菌只存在于人的口腔和唾液中，故可用于唾液、喷溅血等检材的检验推断[32]。Saverio等人针对阴道、口腔和粪便菌群的基因组特异性DNA混合物建立了一种多重实时PCR检测方法，阴道样本显示女性生殖道细菌的强特异信号，口腔样本则呈现出极强的唾液链球菌信号，而粪便样本则为肠球菌信号[33]。该复合体系适用于陈旧检材，能够检测出加氏乳杆菌、卷曲乳杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球、变形链球菌、金黄色酿脓葡萄球菌等6种细菌种类。人体体液中的细菌浓度在108～109cfu/mL左右，该浓度可保证对体液斑迹进行微生物检验的可能性[34]。

2.5 体液组织来源推断相关实验技术

传统的组织来源推断主要有Northern印迹技术以及微阵列芯片技术，Northern印迹技术是较早分析RNA的实验方法，该方法因其所需检测样本量大、操作繁琐、灵敏度低而限制了其广泛应用[35]。而微阵列芯片技术因花费高，只能半定量且常伴有假阳性，故在法医学中的应用也有一定局限性。现在常用的检测技术主要有实时荧光定量PCR以及毛细管电泳技术。实时荧光定量PCR技术是现在法医工作中定量检测RNA的金标准，其高灵敏度可用于检测低丰度的靶分子。而毛细管电泳技术作为国内法医遗传学的主流技术，对mRNA的检测同样适用，该技术还可以实现DNA/RNA的共检测，因此，在体液斑迹鉴定领域具有较好的应用前景，如欧洲DNA分型组织进行的数次实验室间比对测试，主要就是利用毛细管电泳平台进行结果分析和检测。另外，随着二代测序技术的逐渐成熟，越来越多的法医学问题会有望解决，在体液鉴定技术方面，可通过转录组测序技术用来筛选新的遗传标记物，包括lncRNA、circRNA等，同时该技术还可用来对mRNA及miRNA进行测序和定量，能够建立其更精细化的表达模式[25]。

3 各分子标记物的优缺点分析与对策

法医学家一直致力于寻找不同体液斑迹或组织来源的特异性遗传标记物，如MicroRNA、mRNA或DNA甲基化。但是，一方面，体液本身就是一种成分极其复杂的混合物，另一方面，个体因其生活环境、习惯、身体状况、年龄、性别的差异都可能导致表达上的差异。因而单纯寻找某一种特异性标记物可能尚不足以从根本上解决问题，而事实上，各种遗传标记也都其各自的问题。

3.1 使用单一特异性分子标记物进行组织来源推断所存在的问题

RNA是DNA的转录产物，直接指导蛋白质的表达从而决定细胞表型。但是，mRNA十分不稳定，极易降解。法医实践中遇到的检材多为陈旧样本，很可能会因为mRNA不同程度的降解而影响检验结果的准确性。

MicroRNA在生物体内发挥作用的方式是靶向mRNA，通过调节mRNA的表达来间接影响细胞表型。MicroRNA片段短，不易降解，在法医实践中具有良好的应用前景。但是，利用MicroRNA进行体液来源推断研究依然存在问题，一是不同实验室、不同技术手段之间筛选的MicroRNA标记物并非完全一致，可重复性差[21-24]；二是相对mRNA来说，MicroRNA含量较低，提取难度高，对检材需要量就相对较大，这可能是制约MicroRNA解决组织来源推断的瓶颈；三是由于MicroRNAs在不同的生理和病理学过程中表达具有差异性，其异常表达往往与癌症、神经紊乱和心脏疾病等有关，故可能会影响其在法医学中的应用[36]。

DNA甲基化在组织来源推断中的优势在于其DNA含量相对较高，因此检测灵敏性较高[29]，同时有研究发现CODIS 20个STR遗传标记均不含有甲基化敏感的限制性内切酶HhaI的识别位点，即DNA甲基化识别体系与STR分型体系能够互相兼容[37]。但也仍有问题：一是DNA的甲基化修饰属表观遗传学范畴，会受到年龄、疾病等因素的影响，位点筛选及确定需慎重，二是DNA甲基化检测难度较大，虽然未来可能实现用单分子实时测序技术直接进行检测[28]，但目前还只能对其进行间接检测，如使用甲基化敏感性限制性内切酶以及重亚硫酸盐测序法等。

微生物种类在使用中存在的问题在于检材尤其是离体检材被检测到的微生物种类，会因微生物本身的生长或降解而导致其种类发生变化，此外随着人体组织成分的降解以及环境中微生物的滋生等原因，微生物种类也会相异[26]。但鉴于微生物种类的稳定性以及研究方法的复杂性，其价值需进一步研究探讨。

3.2 体液斑迹组织来源推断可结合多种手段实现技术突破

一是要细化样本来源，加大样本量积累，提高数据的可靠性和准确性。与基因组DNA不同，可用于组织来源鉴定的遗传标记大多与表达相关，故个体的年龄、性别、健康状况等都可能影响特异性分子标记物的筛选[36-37]。这就要求在研究过程中，需细化被筛选样本的来源特征，设定兼顾不同年龄、不同性别等多方面因素的实验方案，同时，针对确定的生物大分子如mRNA、MicroRNA以及DNA甲基化等，应进行大量样本的验证工作，以保证实验结论的科学性和准确性。

二是多种遗传标记与技术手段联合运用，综合分析以判断组织来源。上文也有介绍，具备体液特异性的生物大分子在实际应用中各有优劣，因此在实际研究工作中需打破寻找某单一种遗传标记进行推断研究的传统思路，可多种分子标记同时使用[26]。

三是建立DNA/RNA共提取技术，实现检材的充分利用。目前法医DNA的STR分型技术是实现个体识别的主要手段，也是判定和寻找嫌疑人的重要工具。在对体液检材进行组织属性来源推断时，在提取mRNA、MicroRNA等生物大分子的同时，更要保证DNA的有效利用。因此，实现DNA/RNA高效共提取技术，可实现生物检材的最大效率使用，从而提供尽可能多的破案信息。

四是建立并提高针对微量检材RNA提取的手段与能力。目前比较成熟和完善的组织特异性分子标记物主要是RNA（包括mRNA和MicroRNA），而针对RNA的检测手段十分成熟，基于电化学传感器的体液MicroRNA其检测灵敏度甚至可达0.1pmol[38]。然而由于mRNA的稳定性相对较差，而MicroRNA的含量又相对较低，微量生物检材中RNA的提取难度较大。因此实现现场微量生物物证组织属性的准确判定，可能受制于生物标记物（如RNA）的提取技术。

4 展望

新的刑诉法对于物证检验鉴定工作提出了更高要求，为了适应新刑诉法实施的需要,生物物证应为案情提供更多的信息，而对生物检材的组织属性来源判定就很重要。目前，针对生物大分子如mRNA、MicroRNA以及DNA甲基化等的筛选和检测手段日趋成熟，基于宏基因组分析的微生物研究也愈益完善，新的特异性分子标记物也被不断报道，这些都为建立法医学适用的特异性生物大分子检测技术从而推断生物物证组织的属性来源提供了帮助和支持。

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