长链非编码RNA SNHG3在神经胶质瘤中的表达及临床意义

罗 涛，彭细娟，杨彦龙

空军军医大学第二附属医院，陕西西安 710038 1神经外科；2重症医学科

神经胶质瘤亦被称作胶质细胞瘤，简称为胶质瘤，主要发生于神经外胚层，是一种常见的恶性肿瘤，占所有颅内肿瘤的35.26% ～ 60.96%[1]。胶质瘤的常见分类有星形细胞瘤、星形母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、少枝胶质细胞瘤等[2]。因其多呈浸润性生长，并与正常脑组织无明显分界，故具有“三高一低”的特点，即发病率高、死亡率高、复发率高及治愈率低[3]。到目前为止，针对胶质瘤的治疗仍以手术为主(显微外科手术、神经导航手术、术中荧光实时导航下胶质瘤切除术)，并辅以放疗和化疗[4]。然而肿瘤细胞对放疗的辐射耐受程度可能引起残余病灶再次复发，这使其至今仍是治疗困难、预后最差的一类中枢系统肿瘤[5-6]。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类转录本长度超过200个核苷酸的无编码功能的RNA分子。最初有研究者认为其是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物，不具备生物学功能[7]。但目前多项研究发现lncRNA可以在表观遗传水平、转录和转录后水平调控基因表达，参与调控细胞的不同生物学进程，包括细胞周期、基因稳定性及染色质结构等，而且在一系列不同类型的细胞和疾病中发挥着重要的作用。这表明长链非编码RNA对细胞功能的调控几乎无处不在[8-9]。核仁小分子RNA宿主基因(SNHG)是对恶性肿瘤具有重要生物学调控作用的一类长链非编码RNA[10-11]。其中的SNHG3，也称为U17的宿主基因(U17HG)，位于1号染色体短臂3区6号带。先前有相关研究表明，lncRNA SNHG3的表达可能在肝癌的发生和发展过程中发挥关键作用[12-13]。然而，目前有关SNHG3在神经胶质瘤中作用的研究极少，其在胶质瘤中表达的临床意义尚不清楚。本实验采用实时荧光定量技术，通过检测SNHG3在70例不同级别胶质瘤组织和30例正常脑组织中的表达水平差异，分析SNHG3在胶质瘤组织中的表达与胶质瘤临床病理因素之间的相关性，并分析SNHG3对胶质瘤患者的预后价值。

资料和方法

1 资料 采集空军军医大学第二附属医院神经外科自2008年6月- 2013年6月收治的70例脑胶质瘤患者临床资料和肿瘤组织样本，同时采集同期入院进行颅脑外科手术的30例病例正常脑组织进行对照。所有样本的获取符合空军军医大学第二附属医院伦理委员会的协议，参与到本研究的患者均已签署知情同意书。入选患者经手术病理学确诊，组织病理采集前患者均未进行放、化疗治疗或其他抗癌治疗。入选患者年龄在25 ～ 75岁，平均年龄为50岁，年龄＜50岁30例，≥50岁40例；其中男性32例，女性38例；KPS评分≥80分27例，＜80分43例；肿瘤直径＜4 cm 26例，≥4 cm 44例；单发肿瘤33例，多发肿瘤37例；术后复发34例，未复发36例。按照WHO(2007年)神经系统肿瘤分类的标准分级：Ⅰ级～Ⅱ级29例，Ⅲ级～Ⅳ级41例。

2 提取RNA以及SNHG3检测 将证实有肿瘤细胞存在的胶质瘤组织标本和正常脑组织标本进行脱蜡处理，采用Trizol法(Invitrogen，CA，USA)提取组织标本中的总RNA。用紫外分光光度计测定组织标本在波长为260 nm以及280 nm处的吸光度比值，计算RNA浓度并评估纯度，选取OD值在1.9 ～ 2.0的RNA样品。根据逆转录试剂盒说明将RNA样品逆转录为cDNA。然后应用RT-PCR法分别检测神经胶质瘤组织和正常脑组织标本中SNHG3的表达水平，内参基因设置为GAPDH。SNHG3扩增条件：95℃预变性30 s，随后95℃、5 s，60℃、34 s，共40个循环。引物及探针序列，SNHG3上游引物正向：5'-CAGTGGTCGCTTCTTCT CCTT-3'，下游引物反向：5'-GGCATGAAATGCAC CTCAAT-3'，GAPDH上游引物正向：5'-TGTTGCC ATCAATGACCCCTT-3'，下游引物反向：5'-CTCCA CGACGTACTCAGCG-3'。所有qRT-PCR的引物特异性和效率性均经过检验。使用2-ΔΔCt相对定量方法计算倍数变化，所有实验至少重复3次。

3 随访 术后对患者进行3个月1次的定期随访，短期随访主要以门诊复诊形式进行，远期随访主要以电话随访形式进行。随访截止时间为2018年6月。随访内容为一般资料、KPS评分以及术后是否复发。

4 统计学分析 应用SPSS22.0(SPSS Inc，Chicago，IL，USA)软件对实验数据进行统计分析，计量资料以-x±s表示，组间比较应用t检验；参数资料分析采用χ2检验，采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，组间比较用log-rank检验，应用单因素和多因素Cox比例风险回归模型评估胶质瘤患者不同临床病理特征与临床预后之间的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 神经胶质瘤组织中SNHG3表达水平高于正常脑组织 RT-PCR的检测结果发现，SNHG3在神经胶质瘤组织中表达水平与正常脑组织相比明显上调 (2.764±0.280 vs 1.000±0.297，P=0.001)。同时数据显示，SNHG3的表达水平随着胶质瘤恶性程度的增高而增高(WHOⅠ～Ⅱ级2.110±0.291 vs WHOⅢ～Ⅳ级3.418±0.299，P=0.011)，提示其表达水平与肿瘤的病理级别呈正相关。见图1。

2 SNHG3的表达与胶质瘤临床病理指标的关系SNHG3的平均表达水平为2.764±0.280(1.207 ～4.361)，以SNHG3在胶质瘤组织样本中的表达水平平均值为界值将神经胶质瘤患者分成两组：SNHG3高表达组(n=42)和SNHG3低表达组(n=28)，结果显示神经胶质瘤组织中高表达水平的SNHG3与患者的年龄(P=0.622)、性别(P=0.557)、肿瘤大小(P=0.840)以及肿瘤数目(P=0.171)等因素无关，而与高组织学分级(P=0.007)、低KPS评分(P=0.009)以及患者术后复发(P=0.008)有一定关系。见表1。

3 SNHG3表达水平与胶质瘤患者术后预后的关系

分别用Kaplan-Meier绘制SNHG3低表达组和高表达组的生存曲线，用log-rank进行生存率检验，结果发现，SNHG3表达高者术后预后明显较差，5年生存率显著低于低表达者(高表达组31.4% vs低表达组63.0%，P=0.012)，提示SNHG3可能成为预测胶质瘤预后的指标。见图2。4 SNHG3的表达与胶质瘤临床病理指标的单因素和多因素分析 为了探究影响预后的独立因素，我们首先将之前统计的相关临床病理指标与生存率进行了单因素分析，然后将单因素分析结果中有统计学意义的指标进行多因素COX回归分析，结果表明胶质瘤组织的SNHG3高表达、高病理级别、KPS评分＜80分以及术后复发均是影响胶质瘤患者术后预后的独立危险因素。见表2。

表1 LncRNA-SNHG3表达水平与胶质瘤患者各临床病理指标的相关性Tab. 1 Correlation between lncRNA-SNHG3 expression level and clinicopathological indicators in glioma patients (n, %)

图1 LncRNA-SNHG3在正常脑组织和神经胶质瘤组织中的表达水平Fig. 1 Expression level of lncRNA-SNHG3 in normal brain tissue and glioma tissue

图2 LncRNA-SNHG3高表达组和低表达组患者术后生存率比较Fig. 2 Comparison of postoperative survival rates between lncRNASNHG3 high-expression group and low-expression group

表2 胶质瘤患者不同临床病理变量与生存率的单变量和多变量分析Tab. 2 Univariate and multivariate analyses of different clinicopathologic variables and survival rates in glioma patients

讨 论

神经胶质瘤是中枢神经系统中恶性程度最高的原发肿瘤，其具有侵袭力强、易复发、预后差等特点，尤其是胶质母细胞瘤患者中位生存期仅为1年左右[14]。因其多呈浸润性生长，手术很难识别出真正的肿瘤边界，故目前已有的治疗方式效果并不是很理想，复发率较高[15]。为了寻找到一种新的可靠的可预测胶质瘤患者预后的生物学标记物，我们进行了相关研究，希望能寻找到一种新的分子标签，为今后胶质瘤的早期诊断以及评价预后提供新的方法。

大量研究证实，在肿瘤组织中异常表达的lncRNA可影响肿瘤细胞发生发展过程中的重要环节如细胞的增殖、分化或者凋亡[16]。这提示一些lncRNA可能作为肿瘤发生潜在的生物学标记物以及治疗靶点。潘俊辰等[17]的实验首次发现，lncRNA loc285194在胶质瘤样本中低表达且与肿瘤的恶性程度存在相关性，上调loc285194的表达对于胶质增殖的影响可能是通过激活其凋亡相关通路发生，而且脑胶质瘤的生成可能与loc285194的表达缺失有关。此外丁一等[18]的实验表明SPRY4-IT1在脑胶质瘤组织中的表达量高于瘤周组织，其高表达可能通过影响MAPK信号通路促进胶质瘤细胞的迁移，有可能作为胶质瘤的诊断、判断预后的分子标志物及治疗的分子靶点。而Wang等[19]研究证明在U87和U251中过表达lncRNA-MEG3会抑制胶质瘤细胞的增殖，同时还会促进胶质瘤瘤细胞的凋亡。胡泷[20]的研究证实SNHG3与细胞的脂质代谢密切相关，SNHG3可能通过介导转录因子SREBP-lc来调控肝癌细胞的脂质代谢活动。但是，SNHG3在不同级别胶质瘤中的表达水平和临床意义却鲜有相关的研究和结果。

本研究通过分析空军军医大学第二附属医院神经外科2008年6月- 2013年6月收治的70例脑胶质瘤患者的相关病理资料，采用RT-PCR技术检测SNHG3在不同级别神经胶质瘤组织中的表达量。结果表明其在胶质瘤组织中SNHG3表达量明显高于正常组织，并且与胶质瘤的病理级别呈正相关，这提示我们SNHG3可能是促进肿瘤组织发展的原癌基因。进一步通过单因素和多因素分析发现胶质瘤组织中SNHG3较高水平表达、高病理级别，KPS评分＜80以及术后复发均为影响预后的独立因素。生存分析显示，SNHG3高表达组术后5年生存率显著低于SNHG3低表达组。

综上，本研究证实了SNHG3在胶质瘤组织中的表达水平显著增高，且高表达水平的SNHG3是造成胶质瘤患者不良临床预后的重要原因。但是我们尚未探讨SNHG3促进胶质瘤发展的作用机制。由于SNHG3在胶质瘤组织中表达上调，接下来我们将主要围绕SNHG3可能促进胶质瘤发展的作用机制展开研究，寻找SNHG3的调控或参与的信号通路，从而阐明况SNHG3的调控模式。