响应面法优化生物活菌剂解淀粉芽孢杆菌JT-84发酵工艺

钱文静，胡永红，杨文革

（材料化学与化学工程国家重点实验室，南京工业大学，江苏 南京 211816）

生物农药具有高效、低毒、低残留等优点，近年来在农业生产中逐渐取代化学农药的地位。解淀粉芽孢杆菌是一种芽孢杆菌属的好氧革兰氏阳性杆菌，具有广谱抑菌活性，原因是这种菌株可以产出多种抑菌物质，对多种病原菌具有抑菌作用[1～3]，其制剂已在农业病虫害防治上得到了广泛应用。菌株产抗菌物质的能力对微生物相关产品如生物农药的开发和应用具有决定性作用，这其中的关键步骤就是微生物发酵条件的优化。

近年来，有关学者对解淀粉芽孢杆菌的培养基及发酵条件进行了优化[4～12]。响应面法（Response surface methodology，RSM） 由Box和Wilson于1951年首次报道。该方法所需试验次数少，且可以预测因素之间的相互作用，被越来越多的研究者使用[13]。JT-84是我们具有自主知识产权的解淀粉芽孢杆菌，采用单因素试验和响应面法对其培养基与发酵条件进行优化，以期获得更多的菌体，旨为进一步提高其生防效果、降低发酵成本提供保障，且对后期的产业化放大和推广应用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种 解淀粉芽孢杆菌JT-84，由材料化学与化学工程国家重点实验室自主保藏。

1.1.2 培养基

1.1.2.1 活化培养基。葡萄糖2.5 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，琼脂15 g/L。

1.1.2.2 种子培养基。葡萄糖2.5 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L。

1.2 试验方法

1.2.1 种子液的制备 将活化后的解淀粉芽孢杆菌JT-84接于装有200 mL培养液的500 mL锥形瓶中，在30℃条件下150 r/min摇瓶培养20 h。

1.2.2 生物量的测定 用紫外分光光度计，在波长600 nm处测定解淀粉芽孢杆菌JT-84发酵液的吸光值（OD600）。以无菌培养液作为对照。依据OD600判断菌体的生物量，OD600越大，表明菌体的生物量越大。

1.2.3 发酵培养基的优化

1.2.3.1 单因素试验。以发酵初始培养基为基础培养基，分别添加碳源、氮源和无机盐配成不同种类的发酵培养基，其他成分不变，在30℃条件下摇瓶（转速140 r/min） 培养24 h；测定解淀粉芽孢杆菌JT-84发酵液的OD600，并根据OD600对单因素发酵条件的3个较高水平进行筛选。

（1）碳源对菌体发酵的影响。在基础培养基中添加唯一碳源10 g/L配成发酵培养基，试验碳源种类设葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇、可溶性淀粉和乳糖6个处理；以不添加碳源的基础培养基作为对照。

（2）氮源对菌体发酵的影响。在基础培养基中添加唯一氮源10 g/L配成发酵培养基，试验氮源种类设（NH4）2SO4、尿素、NaNO3、酵母粉、蛋白胨和牛肉膏6个处理；以不添加氮源的基础培养基作为对照。

（3）无机盐对菌体发酵的影响。在基础培养基中添加唯一无机盐2 g/L配成发酵培养基，试验无机盐种类设 CuSO4、MgSO4、NaCl、ZnCl2、CaCl2和 KCl计6个处理；以不添加无机盐的基础培养基作为对照。

1.2.3.2 Plackett-Burman（PB） 试验 依据单因素试验优化结果，利用Design Expert软件对PB试验方案进行设计，每个变量均设置低（-） 和高（+） 2个水平，其中高（+） 水平用量是低（-） 水平的1.5倍。另外安排2个虚拟变量，用于估计误差。每组试验均设3次重复，结果取平均值。根据发酵液的OD600，筛选出对解淀粉芽孢杆菌JT-84发酵影响较显著的碳源、氮源和无机盐。

1.2.3.3 最陡爬坡试验。在上述试验中可获得影响比较显著的因素，根据PB试验，计算得出一次项拟合方程中的各个相应变量系数，据此确定爬坡方向和变化梯度。如果变量系数为负，则该变量水平将以递减的方向进行爬坡试验；相反，变量水平则以递增的方向进行，快速明显地逼近最佳区域。在设计试验方案中，以此得到的解淀粉芽孢杆菌JT-84发酵液OD600最优点成为中心组合设计试验的中心点。

1.2.3.4 响应面分析法。根据Box-Bellnken原理，对经过PB试验和爬坡试验筛选出的变量进行5水平（-α、-1、0、+1、+α） 试验。利用Design-Expert软件对试验结果进行分析，筛选解淀粉芽孢杆菌JT-84的最佳发酵培养基配方。

1.2.4 发酵条件的优化 在优化后的发酵培养基基础上，对JT-84菌株接种量、培养基初始pH值、发酵温度、摇瓶转速及发酵时间进行优化。接种量设装液量的6%、8%、10%、12%、14%和16%；培养基初始pH值设6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5；发酵温度设22、24、26、28、30和32℃；摇瓶转速设120、140、160、180、200和 220 r/min；发酵时间设 12、24、36、48、72和96 h。以发酵液OD600最大值的组合，为试验因素的最佳水平。

2 结果与分析

2.1 解淀粉芽孢杆菌JT-84发酵培养基的优化

2.1.1 单因素试验结果

2.1.1.1 碳源对解淀粉芽孢杆菌JT-84发酵的影响。构成菌体的基本骨架以及菌体生长的能量来源都是碳源。葡萄糖、蔗糖、麦芽糖处理的解淀粉芽孢杆菌JT-84发酵液OD600分别为0.973、0.891和0.782，居参试碳源前3位（图1）。因此，在之后的PB试验设计时，考察的碳源对象为葡萄糖、蔗糖和麦芽糖。

2.1.1.2 氮源对解淀粉芽孢杆菌JT-84发酵的影响。菌体生长离不开氮源，在合成各种细胞器和遗传物质时均需要氮源，菌体在生长过程中调节生物量发挥重要作用的是氮源。酵母粉、蛋白胨、牛肉膏处理的解淀粉芽孢杆菌JT-84发酵液OD600分别为0.982、0.943和0.841，居参试氮源前3位（图2）。因此，在之后的PB试验设计时，考察的氮源对象为酵母粉、蛋白胨和牛肉膏。

图1 不同碳源对解淀粉芽孢杆菌JT-84发酵的影响Fig.1 The effects of various carbon sources on the fermentation of B.amyloliquefaciens JT-84

图2 不同氮源对解淀粉芽孢杆菌JT-84发酵的影响Fig.2 The effects of various nitrogen sources on the fermentation of B.amyloliquefaciens JT-84

2.1.1.3 无机盐对解淀粉芽孢杆菌JT-84发酵的影响。无机盐在微生物的生命活动中不可或缺，其在调节菌体的渗透压和酸碱度等活动，以及维持微生物自身酶合成与抑制等活动中均发挥着重要作用。CaCl2、MgSO4、KCl处理的解淀粉芽孢杆菌JT-84发酵液OD600分别为0.843、0.756和0.574，居参试无机盐前3位（图3）。因此，在之后的PB试验设计时，考察的无机盐对象为CaCl2、MgSO4和KCl。

图3 不同无机盐对解淀粉芽孢杆菌JT-84发酵的影响Fig.3 The effects of various inorganic salts on the fermentation of B.amyloliquefaciens JT-84

2.1.2 Plackett-Burman（PB） 试验结果 单因素优化试验结果显示，解淀粉芽孢杆菌JT-84发酵培养基的主要影响因素有麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、MgSO4、CaCl2和KCl。因此，选用这9个主要变量和2个虚拟变量进行PB试验方案设计（表1和2）。

表1 PB试验设计的变量及其不同水平的用量Table 1 Factors and levels of PB experiment

使用Design-Expert软件对表2试验结果进行方差分析，R2=0.999 7，表明PB试验模拟效果好。筛选出的9个主要影响因素中，有5个因子对解淀粉芽孢杆菌JT-84发酵影响显著，重要性顺序为CaCl2＞KCl＞葡萄糖＞酵母粉＞蛋白胨（表3），表明对解淀粉芽孢杆菌JT-84发酵影响显著的培养基碳源、氮源、无机盐分别是葡萄糖、酵母粉和CaCl2。因此，选择葡萄糖、酵母粉和CaCl2这3个因子作为下一步优化试验的考察因素。

2.1.3 最陡爬坡试验结果 通过PB试验筛选出了影响显著的3个变量，其模型方程为Y=0.74＋0.053b＋0.060e＋0.11h，3个变量的系数均为正值，因此，试验应进行正爬坡设计。随着葡萄糖、酵母粉和CaCl2浓度的逐渐增大，解淀粉芽孢杆菌JT-84发酵液的OD600呈先升高后降低的变化趋势，其中，试验编号E组合的OD600最大，达到了1.256（表4）。因此，以葡萄糖17 g/L、酵母粉17 g/L、CaCl21.4 g/L为中心值设计后续的响应面试验。

表2 PB试验设计与结果Table 2 The design and results of PB experiment

表3 PB试验结果的方差分析Table 3 The variance analysis of PB experiment

2.1.4 响应面法优化结果 通过PB试验和爬坡试验筛选出了葡萄糖、酵母粉和CaCl2的适宜浓度。根据Box-Bellnken原理，通过Design-Expert软件对这3个变量进行5水平（-α、-1、0、+1、+α） 的响应面试验设计（表5和6），共20组试验。

使用Design-Expert软件进行拟合，得到三元二次回归方程为 Y=-1.792 7＋0.050 4A＋0.242 2B＋1.194 8C＋2.177 2×10-3AB-0.012 8AC-0.024 3BC-1.280 3×10-3A2-0.011 6B2-0.172 8C2。其中，A为葡萄糖浓度（g/L），B为酵母粉浓度（g/L），C为CaCl2浓度（g/L），Y为解淀粉芽孢杆菌JT-84发酵液OD600。方差分析结果（表7） 显示，模型P＝0.000 2，R2=0.921 6，表明该模型显著，拟合度较好。

表4 最陡爬坡试验设计与结果Table 4 The design and results of steepest ascent experiment

表5 响应面试验设计的各因素及其不同水平的用量Table 5 The factors and levels of response surface experiment

根据上述回归拟合方程，将任一因素固定在恒定值（取0水平），绘制响应面曲线和等高线（图4～6），得到另外2个因素交互作用的影响结果。进一步研究相关变量之间的交互作用，并确定最优点。

从图4可以看出，CaCl2浓度固定为2.00 g/L时，酵母粉与葡萄糖的交互作用对发酵液OD600影响显著。随着葡萄糖和酵母粉浓度的升高，发酵液OD600均呈先上升后降低的变化趋势，曲面的顶点即为发酵液OD600的最大值点。葡萄糖和酵母粉浓度超过一定范围后继续升高，发酵液的OD600开始下降，这是由于碳源和氮源浓度过高会导致细胞代谢不平衡，发酵过程后期生长缓慢，产生代谢废物变多，最终使菌体代谢异常。

表6 响应面试验设计与结果Table 6 The design and results of response surface experiments

表7 回归方程模型及方差分析Table 7 ANOVA of quadratic polynomial model

图4 酵母粉与葡萄糖交互影响的OD600响应面图（a）和等高线图（b）Fig.4 Response surface（a） and contour map（b） of OD600of interaction between yeast powder and glucose

从图5可以看出，酵母粉浓度固定为10.00g/L时，CaCl2与葡萄糖的交互作用对发酵液OD600影响显著。随着葡萄糖和CaCl2浓度的升高，发酵液OD600均呈先上升后降低的变化趋势，曲面的顶点即为发酵液OD600的最大值点，其中CaCl2浓度的变化对发酵液OD600影响较大。盐浓度过高或过低都会对细胞内渗透压产生影响，导致细胞失水或吸水，影响细胞的正常生长发育代谢。

图5 葡萄糖与CaCl2交互影响的OD600响应面图（a）和等高线图（b）Fig.5 Response surface（a） and contour map（b） of OD600of interaction between glucose and CaCl2

从图6可以看出，葡萄糖浓度固定为20.00 g/L时，CaCl2与酵母粉的交互作用对发酵液OD600影响显著。随着酵母粉和CaCl2浓度的升高，发酵液OD600均呈先上升后降低的变化趋势，曲面的顶点即为发酵液OD600的最大值点。该图与图5相比起伏更大一些，说明酵母粉浓度对发酵液OD600的影响大于CaCl2浓度对发酵液OD600的影响，即酵母粉较CaCl2对菌株生长的影响更大。

图6 酵母粉与CaCl2交互影响的OD600响应面图（a）和等高线图（b）Fig.6 Response surface（a） and contour map（b） of OD600of interaction between yeast powder and CaCl2

对回归方程中的变量求一阶偏导数，得到培养基的最佳配方为A=17.51g/L，B=9.88g/L，C=2.11g/L，通过数据预测的发酵液OD600为1.228。在最佳培养基（葡萄糖17.51g/L、酵母粉9.88g/L、CaCl22.11g/L） 条件下进行发酵验证试验，3次重复，结果取平均值，结果显示，测得的解淀粉芽孢杆菌JT-84发酵液OD600为1.216，与预测值相差不大。因此，得到优化后的培养基配方为葡萄糖17.51 g/L、酵母粉9.88 g/L、CaCl22.11 g/L。

2.2 解淀粉芽孢杆菌JT-84发酵条件的优化

2.2.1 最佳接种量的筛选 接种量对发酵周期以及发酵产物的质量和产量均有重要影响。如果接种量过高，培养基会被迅速消化，导致大量次级代谢产物堆积，抑制菌体生长。如果接种量过低，则会引起发酵迟缓期过长，使得整个发酵过程易被污染等。发酵液OD600随着接种量的增加呈先增加后降低的变化，其中接种量8%处理的指标值最大，OD600为1.236（图7）。因此认为，解淀粉芽孢杆菌JT-84发酵的最佳接种量为8%。

2.7.2 最佳初始pH值的筛选 pH值对微生物生长有一定影响，其不仅能影响菌体本身细胞膜上的电荷，还能影响其所需培养液的离子化过程。发酵液OD600随着初始pH值的增大呈增加—降低—增加—降低的变化，其中pH值6.5处理的指标值最大，OD600为1.257（图8）。因此认为，解淀粉芽孢杆菌JT-84发酵的最佳初始pH值为6.5。

图7 接种量对解淀粉芽孢杆菌JT-84发酵的影响Fig.7 The effect of inoculation amount on the fermentation of B.amyloliquefaciens JT-84

2.2.3 最佳发酵温度的筛选 菌体自身生长和产物的代谢都与外界温度密切相关，将菌体放置在合适的温度条件下能明显促进其生长，反之，会抑制其正常生长，甚至会杀死菌体。众所周知，菌体自身体内酶的合成和能量的代谢等活动都会受到温度的影响。发酵液OD600随着发酵温度的升高呈先增加后降低的变化，其中温度28℃处理的指标值最大，OD600为1.274（图9）。因此认为，解淀粉芽孢杆菌JT-84发酵的最佳温度为28℃。

2.7.4 最佳转速的筛选 摇瓶转速不仅影响培养基的通气量和溶氧量，还影响菌体的形态，因此，微生物的正常生长也受到摇瓶转速的影响。发酵液OD600随着摇瓶转速的增加呈先增加后降低的变化，其中转速140 r/min处理的指标值最大，OD600为1.283（图10）。因此认为，解淀粉芽孢杆菌JT-84发酵的最佳摇瓶转速为140 r/min。

图9 温度对解淀粉芽孢杆菌JT-84发酵的影响Fig.9 The effect of temperature on the fermentation of B.amyloliquefaciens JT-84

图10 转速对解淀粉芽孢杆菌JT-84发酵的影响Fig.10 The effect of rotating speed on the fermentation of B.amyloliquefaciens JT-84

2.7.5 最佳发酵时间的筛选 发酵时间直接影响菌体的生物量。在最佳培养基与最佳培养条件的基础上，对发酵时间进行优化，以筛选出菌体生物量最高的发酵时间。发酵液OD600随着发酵时间的延长呈先增加后降低的变化，其中，发酵时间48 h处理的指标值最大，OD600为1.296（图11）。因此认为，解淀粉芽孢杆菌JT-84发酵的最佳时间长度为48 h。

3 结论与展望

图11 发酵时间对解淀粉芽孢杆菌JT-84发酵的影响Fig.11 The effect of fermentation time on the fermentation of B.amyloliquefaciens JT-84

通过单因素法筛选出对解淀粉芽孢杆菌JT-84发酵影响较为适宜的碳源、氮源和无机盐离子，包括葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、CaCl2、MgSO4和KCl；然后，经过Plackett-Burman试验设计，筛选得到影响较为显著的因素是葡萄糖、酵母粉和CaCl2；最后，通过响应面试验优化培养基配方，得到解淀粉芽孢杆菌JT-84发酵液 OD600（Y）与发酵培养基葡萄糖浓度（A）、酵母粉浓度（B）和CaCl2浓度（C）关系的方程为Y=-1.792 7＋0.050 4A＋0.242 2B＋1.194 8C＋2.177 2×10-3AB-0.012 8AC-0.024 3BC-1.2803×10-3A2-0.0116B2-0.1728C2，最终确定最优的培养基成分为A=17.51g/L、B=9.88g/L、C=2.11 g/L，此时OD600为1.228。最优培养基验证试验测定结果显示，发酵液OD600平均为1.216，实际测定值与理论预测值吻合程度良好。因此，我们得到最佳培养基配方是葡萄糖17.51 g/L、酵母粉9.88 g/L和CaCl22.11 g/L。

在优化发酵培养基的基础上对发酵条件进行了优化，得到优化后的培养条件为接种量8%、初始pH值6.5、发酵温度28℃、摇瓶转速140 r/min；采用优化后的培养条件进行发酵，结果显示，培养48 h后菌体生物量达到最大。

本研究只是对解淀粉芽孢杆菌JT-84的发酵培养基成分和培养条件进行了优化，今后还需要进行小试和中试，将发酵工艺进一步完善，获得应用于工业化的发酵工艺，为其产业化生产提供理论依据。同时，解淀粉芽孢杆菌具有非常丰富的自身代谢产物，其分泌的抗菌蛋白或多肽类物质等具有较好的生物防治效果。牛力轩等[14]报道了1株解淀粉芽孢杆菌SH-B74，其能够产生脂肽类抗生素bacillopeptin A。朱丽梅等[15]发现了1株解淀粉芽孢杆菌JK-JS3，其能够分泌2，2-二甲基-N-苯丙硫代酰胺和樟脑醛缩氨脲等杀线虫活性物质。朱震等[16]筛选出了1株解淀粉芽孢杆菌XZ-173，其能够分泌具有广谱抑菌性的表面活性素（surfactin）和伊枯草菌素A（iturin A）。薛鹏琦等[17]报道了1株解淀粉芽孢杆菌RJGP16同样也能分泌surfactin和iturin A。石磊等[18]发现了1株能够分泌bacillomycin D的解淀粉芽孢杆菌。目前已经开展了本试验后续对解淀粉芽孢杆菌JT-84分泌的抗菌物质的研究工作，包括抗菌物质的提取和鉴定以及抑菌效果的研究，通过本研究提高了发酵含菌量，从而为今后提高细菌代谢产物并加以研究利用等奠定了基础。

另外，随着分子生物研究技术的不断提高，研究者也发现了更多解淀粉芽孢杆菌的分子功能。邓建良等[19]通过PCR技术对脂肽抗生素合成酶的相关基因进行了研究，并对抗菌粗提液中的活性物质进行了定性定量分析，发现其抑菌成分主要是C14-Fengycin A、C16-FengycinA、C17-Fengycin A、C17-Fengycin B和C16-IturinA这5种脂肽抗生素。Chen等[20]对解淀粉芽孢杆菌FZB42的全基因组序列进行了分析，发现FZB42中含有可编码且具有抗菌作用的聚酮化合物的基因有mln、bae和dfn。因此，发酵条件的优化使得解淀粉芽孢杆菌的大规模生产应用具备了客观条件，相信在不久的未来，解淀粉芽孢杆菌作为一种新型生物农药会被广泛应用。目前，解淀粉芽孢杆菌已用于蔬菜保鲜、工业酶生产和环境保护等众多领域，但在果品保鲜中的研究应用相对较少。因此，研究解淀粉芽孢杆菌抑制果品采后病原菌机理、分离鉴定其抑菌物质也同样具有十分重要的意义。