抗菌肽Indolicidin的研究进展

王 婧， 刁小龙， 陈晓兰， 王帅兵， 陈海峰， 张 龙

(1.江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300； 2.中崇信诺生物科技泰州有限公司，江苏 泰州 225300)

抗菌肽又叫抗微生物肽、抗生素肽，是由多种生物细胞特定基因编码经外界条件诱导产生的一类具有广谱抗细菌、真菌、病毒、原虫，抑杀肿瘤细胞等活性作用的多肽，是宿主细胞先天性免疫的重要效应分子。由于天然生物抗菌肽具有抗菌谱广，热稳定性和水溶性好，对高等动物的正常细胞几乎无毒害作用，不易产生耐药性，安全环保，能提高免疫力，抗氧化[1-2]等诸多优点使其成为国内外研究和开发的热点，有着广阔的开发应用前景。

随着上世纪70年代Boman等首次在惜古比天蚕中发现天蚕抗菌肽以后，至今已从微生物以及动植物中分离得到上千种抗菌肽。来源于哺乳动物的抗菌肽可根据其结构和生物学特征分为防御素类和Cathelicidins两大类[3]。其中，Cathelicidins是哺乳动物抗菌肽前体的一个大家族，最先在猪骨髓中被发现，后来陆续在人、鼠、羊、牛、马等哺乳动物骨髓、外周血、睾丸等组织中被发现，由于这类抗菌肽存在共同相似的Cathelin功能域，故人们称之为Cathelicidins家族。

Indolicidin即为Cathelicidins家族成员之一，它是从牛中性粒细胞胞质颗粒中分离得到的一种抗菌肽，其结构为ILPWKWPWWPWRR-NH2，仅包含6种共13个氨基酸，是目前为止已知的最小的天然线性抗菌肽，该多肽的羧基端被酰胺化，共包含39%的色氨酸残基和23%的脯氨酸残基，这是Cathelicidins家族，甚至是目前已知蛋白质中色氨酸含量最高的[4]。

1 Indolicidin的作用

Indolicidin抗菌谱广，对多种需氧革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌都有很强的抗菌活性，例如铜绿假单胞菌、念珠菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、临床分离的表皮葡萄球菌等，其杀菌量为 0.1～1.0 μmol[5]。Ando利用倍比稀释法研究Indolicidin对于枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌作用，结果显示其对这3种细菌的最低抑菌质量浓度(MIC)分别为3.13 μg/ml、1.56 μg/ml和25.00 μg/ml[6]。Selsted在10 mmol/L的磷酸钠缓冲液中考察indolicidin对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌对数期的杀灭作用，其最低杀菌质量浓度为10 μg/ml[4]。还有学者考察了诸如蜂毒肽、indolicidin、黄蜂毒素等15种短链抗菌肽对粘菌素敏感和粘菌素耐药型的鲍氏不动杆菌的体外活性，结果表明Indolicidin对这2种细菌均具有一定程度的抑制作用，对粘菌素敏感型和粘菌素耐药型的鲍氏不动杆菌的MIC50值分别为8 μg/ml 和16 μg/ml[7]。

不仅如此，Indolicidin还对一些寄生虫(如微小隐孢子虫和卡氏肺囊虫)和病毒有抑制作用。有研究结果表明，单独使用Indolicidin浓度达到50 μmol/L可降低微小隐孢子虫裂殖子浓度至38.5%，与其他药物配合使用效果更好。

还有研究结果表明Indolicidin可以抗人类免疫缺陷病毒(HIV-1)、单纯疱疹病毒，它抗病毒所需浓度比抗细菌和抗真菌时高。Robinson等的研究结果表明Indolicidin对于HIV-1病毒的杀病毒质量浓度为333 μg/ml，37 ℃条件下IC50为 67～100 μg/ml，且表现出直接的剂量依赖性和时间依赖性的杀病毒活性，37 ℃作用5 min即可抑制50%的HIV病毒，而要起到完全抗病毒作用大约需作用60 min[8]。

2 Indolicidin的抗菌机理

由于Indolicidin具有广谱抗细菌活性，加之抗菌肽所具有的优势使其在被发现以来受到了广泛地关注和研究，但是到目前为止它的作用机制并不十分清楚。大多认为多肽的阳离子净电荷数与其抗菌活性关系密切，而其疏水性则与溶血性一致。

早期的研究结果认为，Indolicidin可与细菌胞膜相互作用并形成跨膜离子通道，导致跨膜电位远远偏离正常值，引起细胞内容物外流而使细菌死亡。用Indolicidin处理大肠杆菌细胞时，能诱导细胞出现丝状物质，且在抗细菌物质存在时能够阻碍DNA合成[5]。并且Indolicidin需要达到最低浓度才可影响双脂层的结构，低于该最低浓度检测不到其对细胞膜的影响，而高于该浓度有严重的影响，即使是在高浓度下对膜引起可见的变化仍需一定的时间。在某种意义上Indolicidin在破坏膜的连续性方面有类似于表面活性剂的作用[9]。Yeh等[10]从自由能的变化角度解释了Indolicidin更易吸附于原核细胞而不是真核细胞膜的原因，他认为决定Indolicidin特异性吸附作用的能量因素是由吸附和被吸附两侧的能量总和决定的。基于Indolicidin的抗菌机制可能是靶向于细胞膜，有学者认为这可能是它对有囊膜的病毒也有抑制或杀灭作用的原因[8]。

不仅如此，Indolicidin被证明可以与遗传物质和一些生物大分子相结合，最早由Falla等提出当其浓度足够高时，Indolicidin可能抑制RNA和蛋白质大分子的合成，加之其对细胞膜的渗透作用，推测这可能是其抑菌作用的机理[5]。在随后的研究中，有学者通过利用化学交联和质谱足迹法进行了Indolicidin抑制HIV-1 整合酶的作用机理研究，结果表明Indolicidin可直接与DNA结合阻碍整合酶-DNA复合物的形成，而不是与整合酶相结合。同时它还能影响拓扑异构酶I对DNA进行调节使DNA结构松弛，就此推测Indolicidin通过与DNA的结合可能抑制大量的与DNA加工相关的酶。凝胶电泳试验结果显示随着多肽浓度的增加，所形成的整合酶-DNA复合物逐渐减少，也就是说Indolicidin影响了整合酶与DNA的结合，尤其是Indolicidin的无精氨酸替代物RIN-25浓度在 37～333 μmol/L时可完全抑制整合酶DNA复合物的形成[11]。

虽然有一些学者提出了相反的观点，认为Indolicidin不能与DNA结合[12-13]。但在2014年， Ghosh等[14]在试验中发现Indolicidin十三肽中间的PWWP结构域是一个特殊的结构原件，该结构域能够包绕B-型DNA双螺旋结构，使其稳定性更好，从而对DNA的复制和转录起到了抑制作用。通过荧光显微镜观察利用FITC标记的Indolicidin不仅能够定位于A549肺癌细胞细胞膜，而且能够定位至细胞核，证实了Indolicidin可以结合于双螺旋DNA上，这也间接证明了Indolicidin可能是通过与DNA结合而发挥抑制作用。

双螺旋DNA结构由于有氢键和碱基堆积的作用格外稳定，但是受热后会受到影响，进一步利用圆二色谱和质谱对Indolicidin和DNA复合物热变性进行研究，结果表明，正常DNA解链温度为52.2 ℃左右，而Indolicidin与DNA的复合物的解链温度为63.2 ℃，Indolicidin与DNA的复合物比DNA单独存在时更加稳定。Ghosh等进一步利用A-A、H-H或P-P代替PWWP结构中的WW之后，大大影响了其稳定双螺旋DNA的能力，推测这可能是由于WW被替换后减少了多肽的表面积和疏水性。表明PWWP作为与DNA结合时的识别区域具有重要作用，且其中的色氨酸残基起到了重要作用[14]。

综上所述，推测Indolicidin的抑菌机制可能是由于通过增加细胞膜的通透性，使自身进入细菌内部，一方面能够促使细菌内容物外流，另一方面能够与细菌DNA及DNA复制相关的蛋白质大分子相结合，抑制DNA的复制，从而起到杀菌的作用。

3 Indolicidin的构效关系

研究一个蛋白质或一个基因的功能及其分子机制的主要方法包括过表达、异源表达，基因打靶和基因沉默等手段。而蛋白质实现它的不同功能主要是依靠构成它的氨基酸的化学性质的多样性以及肽链折叠方式的多样性。因此有必要对蛋白质中发挥关键作用的氨基酸功能进行深入研究，可以通过点突变或缺失蛋白质或多肽中的关键氨基酸来探讨其在蛋白质或多肽中的作用以及该蛋白质发挥作用的机理等。

天然抗菌肽具有较多优势，Indolicidin的抗菌活性较广，然而它对真核细胞具有细胞毒性，静脉注射毒性较大，并且具有溶血性等作用限制了其应用和发展。因此对于Indolicidin多肽中各个氨基酸在其活性以及细胞毒性方面发挥的作用有必要进行详细的研究，为了探索Indolicidin中电荷以及色氨酸和脯氨酸对其生物活性的重要性，有学者合成一系列单个或组合突变氨基酸和脯氨酸衍生物并考察其生物活性，从而分析色氨酸及脯氨酸在Indolicidin发挥生物活性过程中的重要角色，为后期对该抗菌多肽进行人工改造等提供科学依据。

3.1 羧基端修饰的重要性

天然Indolicidin的羧基端被酰胺化，为了探讨羧基端被修饰对于Indolicidin的抗菌活性是否有影响，有学者合成了一系列的衍生物。Falla等的试验结果显示，在合成Indolicidin衍生物中羧基端甲酯化比羧基端未甲酯化的Indolicidin抗菌效果好，尤其是对于野生型的大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌以及葡萄球菌属细菌作用效果好，MIC介于 4～64 μg/ml[5]。而另一缺乏C端精氨酸残基的衍生物显示出比Indolicidin的抗细菌活性和抗真菌活性都有所降低[8]。羧基端被修饰后的Indolicidin表现出对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有更好的活性，这可能是由于增加了净正电荷，同时也印证了其能够增加对脂多糖(LPS)的结合能力，从而提高其外膜渗透作用[5]。

3.2 色氨酸的重要性

色氨酸残基能够提高多肽分子进入脂质双分子层的能力，同时也导致了溶血作用的产生。用苯丙氨酸完全取代其中的5个色氨酸对于其抗菌活性并无显著影响，但是其溶血性几乎完全消失。替换后的多肽不能够形成α螺旋或者β-折叠，同时也不能像其他内源性抗菌肽一样透过细胞膜[15]。

后来，Subbalakshmi等[16]进一步合成了在Indolicidin第4位、第8位、第11位中分别保留单个色氨酸，而其他色氨酸被亮氨酸替代，例如：ILPWKLPLLPLRR-am、ILPLKLPWLPLRR-am等，并考察了这些衍生物的生物活性，结果显示这些衍生物对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌仍具有活性，但是与Indolicidin相比稍有降低，但这些衍生物的溶血性却消失了。

Ryge等[17]也证实色氨酸对于Indolicidin的抗菌活性并不是必须的，尽管它含有5个色氨酸。通过利用衍生化的甘氨酸残基或其他非天然氨基酸取代其中的5个色氨酸，并测定这些衍生物的抗菌活性。结果表明，用3-(2-萘基)甘氨酸取代色氨酸的Indolicidin抗菌活性最佳，对于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC值分别为1.2 μmol/L和2.3 μmol/L。用5个修饰的脯氨酸取代色氨酸的Indolicidin显示出抗金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC值至少提高3倍。

后来，Ando等[6]合成了一系列Indolicidin中色氨酸单个替换的衍生物，并考查了这些多肽的抗菌活性和溶血作用，结果显示Indolicidin中第11位的色氨酸对于抗菌活性和溶血活性都相当重要且不可替换成其他氨基酸，而第4位和第9位的色氨酸分别对抗菌活性和溶血活性具有重要作用,第6位和第8位的色氨酸对于生物活性几乎无作用。而Indolicidin的逆向衍生物比Indolicidin具有更好的抗革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)的活性，且其溶血活性显著降低。

3.3 脯氨酸的重要性及其他

Indolicidin中含有大量的色氨酸和脯氨酸，脯氨酸主要位于第3位、第7位和第10位，最初有人认为Indolicidin中的3个脯氨酸残基对于其生物活性并无重要作用，利用丙氨酸替换其中的3个脯氨酸后抗菌活性并未消失，然而溶血活性却有所增加[15]。利用丙氨酸取代脯氨酸的衍生物，可增强其抗G+菌的活性[18]。用赖氨酸替换脯氨酸合成一系列衍生物，其抑菌活性、抗炎活性、中和LPS的能力与Indolicidin相当，且对机体没有细胞毒性，有望成为新型的抗菌药物[19]。

后来有试验用丙氨酸替换1个或多个脯氨酸后，考察脯氨酸对Indolicidin的结构和功能的影响。最低抑菌浓度试验和扫描电镜试验结果证明脯氨酸对抗菌活性和对细胞膜的分解具有重要作用。利用荧光光谱和动态光散射仪研究这些多肽与脂多糖LPS的亲和力试验证实其能分解LPS膜。这些结果表明脯氨酸对Indolicidin与脂多糖的相互作用至关重要，且第3位和第10位脯氨酸残基对Indolicidin发挥抗菌活性尤为重要。推测该抗菌肽中出现多个脯氨酸是为了让Indolicidin能够更好地适应不同构型的“LPS”，可能是Indolicidin有多重作用机制的原因[20]。

在Indolicidin中引入赖氨酸(例如：ILKKWPWWPWRRK)，并且将其C端甲基酯化，该衍生物较Indolicidin活性提高4倍且无溶血性[21]。研究结果反映了净正电荷对于其抗细菌活性的重要性。其他一些Indolicidin衍生物，用异亮氨酸或甘氨酸分别替换第4位、第6位、第8位的色氨酸，衍生物显示出更好的抗细菌活性，然而缺乏这些衍生物溶血性的报道[22]。

4 Indolicidin的其他衍生物

由于Indolicidin具有较大的细胞毒性限制了其使用，为了减少其细胞毒性并提高其抗菌活性，对其进行结构修饰或者在其基础上设计衍生物或新型抗菌肽是较常见的方法。在Park等合成的一系列衍生物中，除K2L6W3外的其他衍生物对耐甲氧西林葡萄球菌和多重耐药绿脓杆菌的抑菌作用均比Indolicidin强。在Indolicidin的基础上合成了一系列富含色氨酸的抗菌多肽，并比较了这些多肽与Indolicidin的抗菌活性以及治疗指数等。最终表明其合成的K6L2W3展示出的最佳治疗指数大约是Indolicidin的40倍[13]。

还有人采用和现有抗生素或抗菌肽联合用药或合成杂合肽的方式来考察其抗菌活性及其细胞毒性的变化情况，并发现了一些对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)有效的合成肽。Tsai等[23]还通过试验证实可以通过氨基酸残基的疏水性模块推算对细胞渗透型抗菌肽衍生物进行前期的设计指导。

利用羟基乙酸或者甘氨酸将左氧氟沙星与Indolicidin或细胞渗透型肽(TAT)等抗菌肽相连接，发现左氧氟沙星与Indolicidin的结合物具有稳定的抗菌活性。有趣的是，直接将左氧氟沙星和Indolicidin混合后其抗G-菌的活性也有所提高[24]。有研究结果表明阳离子抗菌肽与抗生素合用时能够起到协同抗菌的作用，并能够协同增强对MRSA细胞膜的破坏作用，因此阳离子抗菌肽也许能够通过单独或联合抗生素使用来治疗MRSA[25]。Jindal等[26]合成了Indolicidin和Rnanlexin天然抗菌肽的13个杂合衍生肽，其中有4个杂合抗菌肽对临床分离的30株肺炎球菌表现出较好的活性，MIC为 7.81～15.62 μg/ml,且这4个杂合肽表现出较好的广谱抗菌活性，抗菌谱包括敏感性和耐多种药的金黄色葡萄球菌等。

Chang等[27]通过固相合成的方法合成了LD-indolicidin，该肽为立体异构型，由交替出现的顺式和反式氨基酸顺次组成，并且该肽对酶的降解具有更好的耐受性。在以LD-indolicidin作为佐剂的H5N1亚型流感灭活苗免疫过的小鼠脾细胞中的IFN-γ比未添加的有明显增高,而特异性抗体IgG没有明显变化，表明LD-indolicidin或许可作为调节免疫反应的佐剂。Huang 等[28]也证实由乳化颗粒和LD-indolicidin组成的联合免疫佐剂能够增强流感灭活疫苗的血清学免疫力。还有研究者发现Indolicidin的衍生物能够使烧伤模型中的抗氧化酶活性先减少后增加，表明其对烧伤有一定的修复作用[29]。Hu等[30]还报道Indolicidin具有一定的基因传递的能力。

5 Indolicidin的发展前景

近年来，对于Indolicidin的结构特性、生物学活性、作用机制及构效关系等的研究取得了显著的进展。Indolicidin的衍生物MBI-226已进入Ⅲ期临床阶段，而Indolicidin的一些其他衍生物已作为治疗痤疮的药物进入Ⅱ期临床试验[31]。但抗菌肽的纯化技术存在困难，合成成本较高，因此利用体外表达技术，通过构建基因工程菌提高其表达量，进一步改进分离和纯化技术，降低其生产成本，对其临床制剂的开发和广泛应用具有重要意义。