丹参川芎嗪注射液对脑出血大鼠神经功能、脑水肿及神经元凋亡的影响研究

张波，伍海军，钟志军，钱朝智，王盛，陈杨，刘昕，邓进，刘健，温权，甘元华

脑出血属中医学“卒中”范畴，指风阳上窜、痰火内扰、气血逆乱致脑络破损、血溢于脑，主要临床表现为突然昏仆、头痛、失语、偏瘫等［1］。脑出血是导致患者肢体功能障碍及死亡的重要疾病之一，部分患者虽然幸存，但因神经系统发生不可逆损伤而出现肢体功能及语言功能障碍［2］。中医学理论认为，离经之血便是瘀血、死血，故脑出血的治疗关键是祛瘀，凡血证总以祛瘀为要，瘀血不去则出血不止、新血不生。丹参川芎嗪注射液为中药复方制剂，主要由盐酸川芎嗪、丹参素组成，主要功效为活血化瘀。现代药理学研究表明，丹参川芎嗪注射液具有抗血小板聚集、降低血液黏稠度、加速红细胞流速及改善微循环等作用［3］。本研究旨在探讨丹参川芎嗪注射液对脑出血大鼠神经功能、脑水肿及神经元凋亡的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 2016年9月—2018年3月，72只清洁级健康SD大鼠由贵州医科大学动物实验研究中心提供（实验动物质量合格证号：1202318），22周龄，体质量250～300 g，平均体质量（282.0±4.5）g。

1.2 主要试剂及仪器 水合氯醛（武汉市和昌化工有限公司生产），多克隆水通道蛋白4（AQP-4）抗体（北京博奥森生物技术有限公司生产），血管内皮生长因子（VEGF）试剂、C反应蛋白（CRP）试剂（美国RD公司分装），细胞凋亡试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司生产），免疫染色一抗、免疫染色二抗（碧云天，南京森贝伽生物科技有限公司生产），丹参川芎嗪注射液（贵州拜特制药有限公司生产，生产批号：20161031），TUNEL检测系统（美国RD公司分装）。

1.3 方法 采用随机数字表法将所有大鼠分为假手术组、脑出血组及药物干预组，每组24只。脑出血组和药物干预组大鼠采用两次自体动脉血注射法［4］构建脑出血模型，以术后注射点无渗出及出血、大鼠出现相应症状为脑出血建模成功；假手术组大鼠注入0.9%氯化钠溶液50 μ1作为对照。3组大鼠均单独给予清水及专用鼠食喂养，以保证营养。药物干预组大鼠于术后第2天开始给予丹参川芎嗪注射液1.67 ml/kg〔半数致死量（61.5士5.3）mg/kg的半量换算后为1.67 ml/kg［5］〕腹腔注射，1次/d。

1.4 神经功能评估方法 采用Zea Longa评分标准［6］评估3组大鼠术前及术后1、3、7、14 d神经功能缺损程度，其中无神经功能缺损记为0分，脑出血部位对侧肢体出现屈曲状态记为1分，行走转圈记为2分，偏瘫或行走时向出血对侧倾倒记为3分，意识消失、完全不能行走记为4分；Zea Longa评分越高提示神经功能缺损越严重。

1.5 VEGF检测方法 3组大鼠均于术后1、3、7、14 d分别脱颈处死6只大鼠，取大鼠心脏血制备血清，采用双抗体酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清VEGF水平，主要步骤如下：室温平衡20 min，取所需板条，设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度标准品50 μl，待测样本孔先加待测样本10 μl、再加样本稀释液40 μl；标准品孔和样本孔中加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100 μl（每孔），用封板膜封住反应孔，37 ℃恒温箱温育60 min；排去液体，吸水纸吸干，每孔加满洗涤液静置1 min，排去洗涤液，吸水纸上拍干，重复上述洗板操作5次；加入底物A、B各50 μl，37 ℃避光孵育15 min；加入终止液50 μl，15 min内在450 nm波长处测定各孔OD值。

1.6 神经元凋亡检测方法 取大鼠心脏血制备血清后从前胸剪开胸壁，于左心室插入9号粗针头并使针尖升至主动脉，用纹氏钳钳夹、固定针头，剪开右心房快速灌注0.9%氯化钠溶液（常温）150 ml，待血液颜色变清、肝脏变白后灌注4%多聚甲醛（4 ℃）400 ml；先快后慢，直至肢体和肝脏变硬，肝脏变苍白后停止灌注；断头，解剖取所需脑组织制作解剖切片。采用TUNEL法检测神经元凋亡情况，每组术后1、3、7、14 d随机取3张切片，荧光显微镜下随机选取6个不相同的观察视野，计数神经元凋亡数量。

1.7 AQP-4检测方法 采用免疫组化染色法检测脑组织AQP-4表达情况，具体步骤如下：脱蜡、水化脑组织切片，蒸馏水漂洗，置于磷酸盐缓冲液（PBS）中；3%过氧化氢（H2O2）阻断10 min，蒸馏水漂洗，置于PBS中10 min；一抗孵育过夜，2 min内采用PBS漂洗3次，IvisionTM二抗试剂HRP标记羊抗鼠/兔通用型，2 min内采用PBS漂洗3次，DAB显色，光镜控制；水洗、复染、脱水、透明、封片。每组术后1、3、7、14 d随机取3张切片，在图像分析光学显微镜下随机选取图像（1:400），以胞膜、胞质出现棕黄色为阳性，每张切片随机取6个不相同观察视野，使用Image-pro Plus 6.0图像分析软件测定平均光密度值作为AQP-4相对表达量。

1.8 统计学方法 采用SPSS 23.0统计学软件进行数据处理，计量资料以（x± s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Zea Longa评分 3组大鼠术前Zea Longa评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；3组大鼠术后1、3、7、14 d Zea Longa评分比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。脑出血组和药物干预组大鼠术后1、3、7、14 d Zea Longa评分高于假手术组，药物干预组大鼠术后7、14 d Zea Longa评分低于脑出血组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

2.2 血清VEGF水平及脑组织AQP-4相对表达量3组大鼠术后1、3、7、14 d血清VEGF水平及脑组织AQP-4相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；脑出血组和药物干预组大鼠术后1、3、7、14 d血清VEGF水平及术后1、3、7 d脑组织AQP-4相对表达量高于假手术组，脑出血组大鼠术后14 d脑组织AQP-4相对表达量高于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05）；药物干预组大鼠术后7、14 d血清VEGF水平高于脑出血组，脑组织AQP-4相对表达量低于脑出血组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

2.3 神经元凋亡数量 3组大鼠术后1、3、7、14 d神经元凋亡数量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；脑出血组和药物干预组大鼠术后1、3、7、14 d神经元凋亡数量多于假手术组，药物干预组大鼠术后3、7、14 d神经元凋亡数量少于脑出血组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表3）。

表2 3组大鼠术后不同时间点血清VEGF水平及脑组织AQP-4相对表达量比较（x±s）Table 2 Comparison of serum VEGF level and relative expression quantity of AQP-4 in brain tissue in the three groups at different time points after operation

表1 3组大鼠手术前后Zea Longa评分比较（x±s，分）Table 1 Comparison of Zea Longa score in the three groups before and after operation

表3 3组大鼠术后不同时间点神经元凋亡数量比较（x± s，个/视野）Table 3 Comparison of number of apoptotic neurons in the three groups at different time points after operation

3 讨论

中医学理论认为，出血性中风是由气火上冲犯脑、络破血溢所致，血溢脉外，瘀阻于脑中，形成脑中“蓄血症”，主要表现为清窍阻塞、嘴唇不直、偏瘫异常；而血水同源、血水互生又可使气血雍滞，血不利则为水，故形成脑中“蓄水症”［7］。脑出血后局部血肿形成引起颅内压急性升高，压迫周围脑组织，造成血液循环障碍、中央部分细胞凋亡或坏死；在缺血再灌注过程中，氧自由基的大量形成及脂质过氧化的增加又导致脑细胞损伤加重［8-9］。因此，血流停滞不仅导致瘀血停滞，还会导致再出血，进而加重脑组织损伤［10］。

丹参川芎嗪注射液为中药复方制剂，现代药理学研究表明，其具有抗血小板聚集、降低血液黏稠度、加速红细胞流速及改善微循环等作用［3］；此外，其还能快速透过血-脑脊液屏障并在脑组织中持久存在。蒋西亚［11］、梁勇［12］研究表明，活血化瘀法能有效改善高血压脑出血患者神经功能，提高患者临床疗效。易智峰等［3］研究表明，丹参川芎嗪注射液能有效促进脑出血大鼠神经功能恢复，减轻病灶占位效应，缓解病灶周围低灌注状态，进而减少缺血半暗带。张波等［13］研究表明，丹参川芎嗪注射液能有效减轻高血压动脉粥样硬化性脑出血患者脑水肿，减少缺血半暗带，改善脑功能。

本研究结果显示，脑出血组和药物干预组大鼠术后1、3、7、14 d Zea Longa评分高于假手术组，药物干预组大鼠术后7、14 d Zea Longa评分低于脑出血组，提示脑出血大鼠存在神经功能缺损，而丹参川芎嗪注射液能有效改善脑出血大鼠神经功能。VEGF是一种具有血管形成和血管通透性的细胞因子［14］，具有刺激血管形成、保护神经元等作用［15］。AQP-4属于水特异性通道蛋白，在脑组织中含量最高，对维持颅内水平衡具有重要作用［16］。张波等［17］研究表明，VEGF和AQP-4可能参与脑出血后脑水肿的形成与消退。本研究结果显示，脑出血组和药物干预组大鼠术后1、3、7、14 d血清VEGF水平及术后1、3、7 d脑组织AQP-4相对表达量高于假手术组，脑出血组大鼠术后14 d脑组织AQP-4相对表达量高于假手术组；药物干预组大鼠术后7、14 d血清VEGF水平高于脑出血组，脑组织AQP-4相对表达量低于脑出血组，提示脑出血大鼠存在脑水肿，而丹参川芎嗪注射液能有效减轻脑出血大鼠脑水肿；分析其原因可能为丹参川芎嗪注射液能有效改善微循环，增加脑灌注及局部代谢，清除自由基，抑制脂质过氧化，稳定细胞膜，减少局部炎性递质和代谢产物，进而改善能量代谢、提高三磷腺苷（ATP）酶活性、降低兴奋性氨基酸含量及胶质细胞AQP-4表达、减少胶质细胞含水量，最终抑制脑水肿。既往研究表明，血肿被免疫细胞分解并释放有害物质可引起脑水肿、炎性反应并激发神经元凋亡程序［18］。本研究结果显示，脑出血组和药物干预组大鼠术后1、3、7、14 d神经元凋亡数量多于假手术组，药物干预组大鼠术后3、7、14 d神经元凋亡数量少于脑出血组，提示脑出血大鼠存在神经元凋亡，而丹参川芎嗪注射液能有效抑制脑出血大鼠神经元凋亡；分析其主要机制可能为AQP-4减少了白介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）等细胞因子释放，使内皮细胞一氧化氮合酶（NOS）表达升高［19］，诱发VEGF增加，促进局部小血管生成，减轻脑水肿及炎性反应，降低Caspase-3表达、增加Bcl-2表达，进而减少细胞凋亡［20］。

综上所述，丹参川芎嗪注射液能有效改善脑出血大鼠神经功能，减轻脑水肿，抑制神经元凋亡。但本研究为动物实验，丹参川芎嗪注射液治疗脑出血的临床效果及机制仍需大量临床研究进一步探究。

作者贡献：张波、伍海军进行文章的构思与设计，负责撰写论文；张波、伍海军、钟志军、钱朝智、王盛、陈杨、刘昕进行研究的实施与可行性分析；钟志军、钱朝智、王盛、温权、甘元华进行数据收集、整理、分析；张波进行结果分析与解释，对文章整体负责，监督管理；邓进、刘健负责文章的质量控制及审校。

本文无利益冲突。