结核分枝杆菌耐对氨基水杨酸相关基因研究进展

郭艳，陈玲

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的一种传染病，耐多药结核病（MDR-TB）是指同时对利福平和异烟肼耐药的结核病，而广泛耐药结核病（XDR-TB）指对异烟肼和利福平耐药同时还对氟喹诺酮类药物及氨基糖甙类注射液耐药的结核病。据统计，2017年全球范围内共有160 684例MDR-TB患者，其中XDR-TB约占8.5%，而约40%的MDR-TB患者集中于印度和中国［1］。我国是结核病高负担国家之一，耐药结核病发病率高于全球平均水平并呈现逐渐升高趋势［2］，而耐药结核病的持续存在给结核病防控工作带来了严峻挑战［3］。与其他细菌感染治疗方案相比，结核病化疗方案周期更长、用药方案更复杂，但整体治疗失败率较高，因此MDR-TB、XDRTB及完全耐药结核病（TDR-TB）发病率、致死率均出现逐年升高趋势。

对氨基水杨酸（PAS）是20世纪40年代研发的有效抗结核药物之一，对结核分枝杆菌具有良好的抑制作用［4］，曾在抗结核治疗方案中具有重要地位，但随着之后其他更有效的抗结核药物出现，PAS地位逐渐下降并远离人们视线，但其仍是目前世界卫生组织（WHO）推荐的有效抗结核药物之一。研究表明，初、复治结核病患者PAS耐药率分别为4.69%、26.00%，仅次于左氧氟沙星，居常用抗结核药物第六位［5］，因此PAS常与其他抗结核药物联用治疗MDR-TB及 XDR-TB［1，6-17］。据调查，2011—2015年 PAS的临床使用呈逐渐增多趋势［6］。

研究表明，PAS与其他抗结核药物联用有利于增强其他抗结核药物疗效并减少其他抗结核药物耐药的发生［10，12］，如增强异烟肼杀菌作用并减少肝功能异常、胃肠道反应等毒副作用的发生，与链霉素联用减少链霉素耐药的发生，与利奈唑胺联用具有协同增效作用等，因此PAS可用于治疗难治性肺结核［7，10，18］。此外，PAS 颗粒制剂及其他改良制剂（PAS衍生物）不仅可提高PAS抑菌活性，还有利于提高患者耐受性，且耐药率较低，因此，对于不能采用其他更有效的二线抗结核药物治疗的MDR-TB或XDR-TB患者，PAS及其改良制剂不失为最好的选择［9，12-15，19］；但有研究表明，PAS使用频率为1次/d较间歇性给药更有利于减少联用药物耐药的发生［12］，但PAS的t1/2较短、每日使用剂量较大，因此其效率降低时并不是最佳联用药物［13-14，17］。本文综述了结核分枝杆菌耐PAS相关基因，旨在为结核分枝杆菌对PAS的耐药机制研究提供参考。

1 PAS的作用机制

PAS属抑菌剂，作为叶酸前体对氨基苯甲酸酯（PABA）的紧密结构类似物，其可与PABA竞争性结合二氢叶酸合酶（DHFS），进而抑制四氢叶酸（THF）的生物合成并导致脱氧尿苷5'-磷酸（dUMP）合成脱氧胸苷5'-磷酸（dTMP）途径受阻，最终造成结核分枝杆菌DNA合成障碍并抑制结核分枝杆菌生长［4，20-21］。此外，PAS还可通过激活二氢蝶酸合酶（DHPS）及DHFS而产生有毒的羟基二氢叶酸，继而抑制二氢叶酸还原酶抗代谢物并干扰二氢叶酸代谢途径、抑制叶酸的生物合成，达到抑制结核分枝杆菌生长的目的［22］。

2 PAS耐药相关基因

PAS的应用虽经历了很长时间，但其具体耐药机制尚未完全清楚。目前研究结果显示，PAS耐药主要与药物靶基因突变有关，已知的PAS耐药相关基因包括thyA基因（Rv2764c）、folC基因（Rv2447c）、ribD基 因（Rv2761）、papA1基因（RV3824c）4种。

2.1 thyA基因 thyA基因全长792 bp，编码胸苷酸合成酶thyA并参与脱氧核糖核苷酸的生物合成，而脱氧核糖核苷酸是DNA生物合成所需dTMP的唯一来源。2004年，RENGARAJAN首次将thyA基因与叶酸途径联系起来，并认为thyA基因突变与PAS耐药相关，后经多项研究证实［20-21，23-30］。thyA基因突变可干扰胸苷酸合酶的合成并导致胸苷酸合酶活性降低，继而影响胸腺嘧啶生物合成所需叶酸途径，而PAS属叶酸拮抗剂，因此推测PAS的耐药机制与叶酸途径受阻有关［21，23-28］。研究表明，对PAS耐药的结核分枝杆菌thyA基因突变频率约为33%［23，25］（见表1），可以是单基因突变，也可以是双基因突变，主要突变类型包括置换、颠换、插入、缺失等［23］，以单个碱基缺失和插入突变为主，其中第19位密码子缺失C、第168位密码子缺失C最为常见［29］。T202A是thyA基因突变的主要位点，约占66%［24-25］，也是thyA基因突变的特异性位点［28］；体外实验表明，thyA基因敲除后结核分枝杆菌对PAS高度耐药，证实thyA基因突变可导致PAS耐药，但由于thyA基因与thyX基因具有相同功能并可以互补，因此单纯敲除thyA基因并不影响体内结核分枝杆菌生长［26］。

2.2 folC基因 folC基因全长1 464 bp，编码参与叶酸途径的DHFS并将叶酸转化为聚谷氨酸衍生物。DHFS的主要作用是催化7，8-二氢蝶酸到二氢叶酸的谷氨酰胺化，后经二氢叶酸还原酶进一步处理形成THF，而THF是甲酰甲硫氨酰-tRNA生物合成所必需的，也是启动原核生物蛋白质合成的关键成分［31］。folC基因突变可导致DHFS活性降低并使PAS无法被活化，从而导致PAS耐药；通过对结核分枝杆菌folC基因进行测序发现，结核分枝杆菌folC基因突变频率约为8%，通过回补实验证实folC基因突变与PAS耐药有关。点突变是folC基因突变的主要类型，而突变位点多种多样［19，22，31-34］，已知突变位点见表1。

2.3 ribD基因 ribD基因又称ribG基因，全长777 bp，主要催化双功能酶核黄素生物合成的第二、第三反应途径，即2，5-二氨基-6-核糖氨基-4（3H）-嘧啶酮5'-磷酸（DAROPP）转化为5-氨基-6-（1H，3H）-嘧啶二酮5'-磷酸酯（ARIPP）。ribD基因能够催化二氢叶酸还原为THF，因此ribD基因过表达可结合二氢蝶啶类似物并使其减少，继而导致PAS耐药［35］。通常情况下，RibD基因表达水平较低，因此不能完全取代dfrA的功能，而ribD基因过表达可替代二氢叶酸还原酶，进而导致PAS耐药［36］。

2.4 papA1基因 papA1基因全长1 546 bp，是聚酮合酶相关基因之一，存在于编码结核分枝杆菌的同一基因组内，参与合成和运输聚酮合酶相关蛋白A1，是结核分枝杆菌生长及其毒力的必需成分，也是结核分枝杆菌SL-1生物合成所必需的［37-38］。papA1基因测序结果仅发现1个无义突变，为papA1基因339位C→T点突变（见表1），因此推测papA1基因可能作为酰基转移酶基因而参与PAS耐药，但由于实验样本较少而暂不能明确papA1基因突变是否与PAS耐药相关［39］。有研究通过对结核分枝杆菌H37Rv papA1基因进行扩增、定点突变、突变修补等证实敲除噬菌体papA1基因可导致无效突变且未找到中间突变体，提示papA1基因是结核分枝杆菌生物合成所必需的基因之一［33］。

3 小结与展望

综上所述，目前已知的PAS耐药相关基因包括thyA基因、folC基因、ribD基因、papA1基因4种，其中thyA基因通过与PABA竞争DHFS而干扰叶酸代谢，导致PAS耐药；folC基因参与形成二氢叶酸类似物，folC基因突变通过影响二氢芥酸酯结合及羟基二异戊酸而导致H2PtePAS谷氨酰胺效率降低，继而导致PAS耐药；ribD基因过表达可影响叶酸代谢，进而导致PAS耐药［30］；papA1基因突变是否与PAS耐药直接相关还需进一步研究证实。

目前研究表明，PAS作用机制及耐药机制除与叶酸代谢途径、酰基转移酶途径有关外，还可能存在其他未知途径，仍需不断深入研究及探索；基因突变是结核分枝杆菌对PAS耐药的主要分子作用机制，其中thyA、folC基因突变导致PAS耐药已经证实并已寻找到多个突变位点，但具体耐药机制仍需进一步研究，而虽有研究表明ribD、papA1基因突变与PAS耐药有关，但尚未找到确切突变位点，仍需进一步研究证实。积极寻找新的抗结核药物或探寻现有抗结核药物的耐药机制并进行相应干预有利于减少结核分枝杆菌耐药的发生，也是有效防控结核病、快速诊断及治疗耐药结核病的重要研究方向，而关于PAS耐药基因及耐药机制的深入研究将有利于保证PAS在MDR-TB/XDR-TB的治疗中发挥应有作用［39］。

表1 已知的PAS耐药相关基因突变位点及药敏试验结果
Table 1 Known drug resistance related gene mutation sites to PAS and drug sensitivity test results

thyA基因G5T 谷氨酸-终止 1/50 0/6 0.125 mg/ml 0.5～1.0 mg/ml LEUNG等［25］G15C 甘氨酸-精氨酸 1/55 0/22 8～32 μg/ml NA MATHYS等［24］G38C 半胱氨酸-丝氨酸 1/50 0/6 0.125 mg/ml 0.5～1.0 mg/ml LEUNG等［25］T52C 丝氨酸-脯氨酸 1/50 0/6 0.125 mg/ml 0.5～1.0 mg/ml LEUNG等［25］G83A 色氨酸-终止 1/55 0/22 ＞128 μg/ml NA MATHYS等［24］G91A 甘氨酸-精氨酸 3/55 0/22 NA NA MATHYS等［24］G91A 甘氨酸-精氨酸 1/55 0/22 NA NA MATHYS等［24］A97G 谷氨酰胺-精氨酸 2/50 0/6 0.125 mg/ml 0.5～1.0 mg/ml LEUNG等［25］C111T 谷氨酰胺-终止 2/55 0/22 ＞128 μg/ml NA MATHYS等［24］A117G 天冬氨酸-甘氨酸 5/50 0/6 0.125 mg/ml 0.5～1.0 mg/ml LEUNG等［25］T118A 亮氨酸-终止 1/55 0/22 ＞128 μg/ml NA MATHYS等［24］G127T 精氨酸-亮氨酸 1/55 0/22 ＞128 μg/ml NA MATHYS等［24］T143C 亮氨酸-脯氨酸 1/55 0/22 ＞128 μg/ml NA MATHYS等［24］T146C 半胱氨酸-精氨酸 1/55 0/22 ＞128 μg/ml NA MATHYS等［24］T152G 苯丙氨酸-缬氨酸 1/50 0/6 0.125 mg/ml 0.5～1.0 mg/ml LEUNG等［25］C153A 酪氨酸-终止 1/55 0/22 ＞128 μg/ml NA MATHYS等［24］C164A 酪氨酸-终止 1/55 0/22 ＞128 μg/ml NA MATHYS等［24］T172C 亮氨酸-脯氨酸 1/55 0/22 ＞128 μg/ml NA MATHYS等［24］G182C 丙氨酸-脯氨酸 1/55 0/22 ＞128 μg/ml NA MATHYS等［24］T183G 亮氨酸-缬氨酸 1/55 0/22 ＜64 μg/ml NA MATHYS等［24］G188A 甲硫氨酸-异亮氨酸 NA 1/6 0.125 mg/ml 0.5～1.0 mg/ml LEUNG等［25］A191G 谷氨酰胺-精氨酸 1/55 0/22 ＜64 μg/ml NA MATHYS等［24］T202A 苏氨酸-丙氨酸 22/55 0/22 ＜128 μg/ml NA MATHYS等［24］A202G 苏氨酸-丙氨酸 32/50 5/6 0.125 mg/ml 0.5～1.0 mg/ml LEUNG等［25］A207G 组氨酸-精氨酸 2/50 0/6 0.125 mg/ml 0.5～1.0 mg/ml LEUNG等［25］G212A 色氨酸-终止 1/22 0/20 NA NA 张宗德等［23］C223A 组氨酸-天冬酰胺 6/22 0/20 NA NA 张宗德等［23］T230G 亮氨酸-精氨酸 1/50 0/6 0.125 mg/ml 0.5～1.0 mg/ml LEUNG等［25］C251G 酪氨酸-终止 1/55 0/22 ＞128 μg/ml NA MATHYS等［24］G259C 丙氨酸-脯氨酸 1/55 0/22 ＜64 μg/ml NA MATHYS等［24］T261G 缬氨酸-甘氨酸 1/55 0/22 ＞128 μg/ml NA MATHYS等［24］C262T 丙氨酸-缬氨酸 1/50 0/6 0.125 mg/ml 0.5～1.0 mg/ml LEUNG等［25］

（续表1）

注：n/N=基因突变菌株/检测菌株，MIC=最低抑菌浓度，NA表示未提及或无相关数据

基因突变位点（碱基） 氨基酸改变 耐药菌株突变频率（n/N）敏感菌株突变频率（n/N）耐药菌株MIC值敏感菌株MIC值 参考文献G263A 缬氨酸-异亮氨酸 1/55 0/22 NA NA MATHYS等［24］G265T 甘氨酸-半胱氨酸 2/50 0/6 0.125 mg/ml 0.5～1.0 mg/ml LEUNG等［25］C327T 异亮氨酸-异亮氨酸 1/22 0/20 NA NA 张宗德等［23］332插入A 谷氨酰胺-精氨酸 3/22 0/20 NA NA 张宗德等［23］C339G 丝氨酸-精氨酸 1/22 0/20 NA NA 张宗德等［23］355缺失C 亮氨酸-缬氨酸 4/22 0/20 NA NA 张宗德等［23］C439T 组氨酸-酪氨酸 1/22 0/20 NA NA 张宗德等［23］T454G 苯丙氨酸-缬氨酸 1/22 0/20 NA NA 张宗德等［23］T490G 酪氨酸-天冬氨酸 1/22 0/20 NA NA 张宗德等［23］550插入C 亮氨酸-脯氨酸 1/22 0/20 NA NA 张宗德等［23］C615G 天冬氨酸-谷氨酰胺 2/22 0/20 NA NA 张宗德等［23］folC基因A40G 谷氨酸-甘氨酸 2/8 0/87 ＞0.125 μg/ml ＜0.125 μg/ml 赵斐［31］T43C 异亮氨酸-酪氨酸 2/8 0/87 ＞0.125 μg/ml ＜0.125 μg/ml 赵斐［31］A43G 异亮氨酸-丙氨酸 1/8 0/87 ＞0.125 μg/ml ＜0.125 μg/ml 赵斐［31］G111A 甘氨酸-丝氨酸 1/8 0/87 ＞0.125 μg/ml ＜0.125 μg/ml 赵斐［31］A112C 天冬氨酸-丙氨酸 1/8 0/87 ＞0.125 μg/ml ＜0.125 μg/ml 赵斐［31］C410T 精氨酸-色氨酸 1/8 0/87 ＞0.125 μg/ml ＜0.125 μg/ml 赵斐［31］papA1基因C339T NA 无义突变 NA NA NA 郑晓静等［39］