罗格列酮对哮喘小鼠肺组织γ氨基丁酸A受体α亚单位及MUC5AC表达的影响研究

吴艳梅，柴雅琴，薛智文，张莉莉，吕建宁，杜小梅，张卓红，张治国，张引亮，张栓宝

哮喘是一种慢性气道炎性疾病，近年来随着环境污染加重，其发病率呈持续上升趋势。据统计，目前全球约有3亿人罹患哮喘，且每年约25万患者死亡［1］。哮喘的主要病理表现为炎症、气道重建及气道黏液过度分泌［2-3］。研究表明，哮喘发作时γ氨基丁酸（GABA）合成酶及γ氨基丁酸A受体α亚单位（GABAARα）参与气道黏液的过度分泌［6］；MUC5AC由气道杯状细胞分泌，可反映气道黏液分泌情况。糖皮质激素是目前治疗哮喘的首选药物，但其不良反应较多，故在临床应用受限。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）可调节糖类及脂类基因转录，与2型糖尿病、肾脏病、动脉粥样硬化等慢性病发生有关，而罗格列酮是PPAR-γ激动剂，具有抗炎、调节免疫等作用［4］。研究表明，PPAR-γ激动剂能抑制免疫因子合成及释放，导致炎性递质减少，进而减轻气道炎症［5］。本研究旨在探讨罗格列酮对哮喘小鼠肺组织GABAARα及MUC5AC表达的影响，为哮喘早期治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 2017年12月—2018年1月，50只健康雌性BABL/C小鼠由陕西中医药大学分子病理学实验室提供，6～8周龄，平均体质量（21.0±2.5）g。将所有小鼠随机分为对照组、哮喘组、地塞米松组、罗格列酮组、联合治疗组，每组10只。

1.2 主要试剂 卵白蛋白（Sigma公司生产），氢氧化铝（上海凌峰化学试剂有限公司生产），地塞米松（辰欣药业股份有限公司生产），罗格列酮（成都恒瑞制药有限公司惠赠），小鼠抗GABAARα单克隆抗体、小鼠抗MUC5AC单克隆抗体（Abcam公司生产，ab33299），BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生产）。

1.3 动物模型制备 实验分为致敏、激发、取材3部分。（1）致敏：造模第1天和第8天，哮喘组、地塞米松组、罗格列酮组及联合治疗组小鼠腹腔注射卵白蛋白/氢氧化铝混合液0.2 ml（含卵白蛋白 50 μg和氢氧化铝35 mg）致敏；对照组小鼠腹腔注射0.9%氯化钠溶液0.2 ml。（2）激发：造模第15天，哮喘组、地塞米松组、罗格列酮组及联合治疗组小鼠给予卵白蛋白20 g/L雾化吸入30 min激发，1次/d，连续激发7 d，观察小鼠呼吸及全身情况，以出现呼吸增快、打喷嚏、口周发绀、腹肌痉挛、点头呼吸为激发成功；其中地塞米松组小鼠于雾化吸入卵白蛋白前30 min给予地塞米松1 mg/kg，罗格列酮组小鼠给予罗格列酮50 μmol/L雾化吸入，联合治疗组小鼠给予地塞米松（1 mg/kg）联合罗格列酮（50 μmol/L）雾化吸入，对照组雾化吸入0.9%氯化钠溶液。（3）取材：最后1次激发后24 h，采用5%水合氯醛400 mg/kg麻醉小鼠，取小鼠肺组织进行检测。

1.4 HE染色 每组各取5只小鼠左肺置于4%多聚甲醛固定24 h，固定结束后将肺组织切成1 cm×1 cm×0.2 cm组织块，装入组织盒，采用乙醇梯度脱水，二甲苯透明处理，石蜡包埋，制作成4 μm切片，采用苏木素-伊红染色（HE染色），观察组织形态及炎性细胞浸润情况。

1.5 蛋白质印迹法 每组各取5只小鼠左肺组织约30 mg，按照BCA蛋白浓度测定试剂盒要求配制蛋白标准工作液，用去离子水稀释待测蛋白样品，取20 μl蛋白样品加入BCA标准工作液200 μl混匀，37 ℃孵育30 min，采用酶标仪（波长562 nm）测定OD值，根据标准曲线计算蛋白浓度。

1.6 聚合酶链反应（PCR） 每组各取5只小鼠左肺组织约30 mg，研磨后加入Trizol 1 ml提取总RNA，逆转录合成cDNA。以2μl cDNA为模板行PCR，设定PCR参数，参照江刚等［7］实验数据设置41 ℃水浴，PCR反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性5 s，60 ℃退火1 min，反应40个循环后再延伸95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。GABAARα引物序列为F：5'-CAACAGCTA TGGACTGGTTTATTG-3'，R：5'-GCATACCCTCTCTTG GTGAAA-3'，扩增长度100 bp；MUC5AC引物序列 为 F：5'-TGATGGCCTAGTTGTTGAGC-3'，R：5'-ATCTGGCGGAGCAGTTCTT-3'，扩增长度368 bp；参数GAPDH引物序列为F：5'-GGGTGTGAACCACGA GAAATA-3'，R：5'-GTCATGAGCCCTTCCACAAT-3'，扩增长度129 bp。PCR结束后，采用核酸蛋白测量仪检测目的基因mRNA相对表达量。

1.7 统计学方法 采用SPSS 17.0统计学软件进行数据处理，计量资料以（x± s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织病理学表现 HE染色结果显示，对照组小鼠气道黏膜上皮正常，气道周围无明显炎性细胞浸润；哮喘组小鼠气道黏膜上皮局部脱落，黏膜下充血水肿，支气管壁及血管壁周围有较多炎性细胞浸润；地塞米松组、罗格列酮组及联合治疗组小鼠上述表现较哮喘组减轻，见图1。

2.2 肺组织GABAARα、MUC5AC蛋白浓度 各组小鼠肺组织GABAARα、MUC5AC蛋白浓度比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；哮喘组、地塞米松组、罗格列酮组及联合治疗组小鼠肺组织GABAARα、MUC5AC蛋白浓度高于对照组，地塞米松组、罗格列酮组及联合治疗组小鼠肺组织GABAARα、MUC5AC蛋白浓度低于哮喘组，差异有统计学意义（P＜0.05）；而地塞米松组、罗格列酮组及联合治疗组小鼠肺组织GABAARα、MUC5AC蛋白浓度比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表1、图2）。

图2 5组小鼠肺组织GABAARα、MUC5AC蛋白电泳图Figure 2 Protein electrophoresis results of GABAARα and MUC5AC in lung tissue in the five groups

2.3 肺组织GABAARα、MUC5AC mRNA相对表达量 各组小鼠肺组织GABAARα、MUC5AC mRNA相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；哮喘组、地塞米松组、罗格列酮组及联合治疗组小鼠肺组织GABAARα、MUC5AC mRNA相对表达量高于对照组，地塞米松组、罗格列酮组及联合治疗组小鼠肺组织GABAARα、MUC5AC mRNA相对表达量低于哮喘组，差异有统计学意义（P＜0.05）；而地塞米松组、罗格列酮组及联合治疗组小鼠肺组织GABAARα、MUC5AC mRNA相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表2）。

表1 5组小鼠肺组织GABAARα、MUC5AC蛋白浓度比较（x±s）Table 1 Comparison of protein concentration of GABAARα and MUC5AC in lung tissue in the five groups

3 讨论

图1 5组小鼠肺组织病理学表现（HE染色）Figure 1 Pathological features of lung tissue in the five groups

表2 5组小鼠肺组织GABAARα、MUC5AC mRNA相对表达量比较（x± s）Table 2 Comparison of mRNA relative expression quantity of GABAARα and MUC5AC in the five groups

哮喘是以气流受限可逆为特征的慢性气道炎性疾病，主要病理表现为气道炎症及气道重塑。既往研究表明，哮喘黏液高分泌与气道重塑有关，是哮喘气道上皮杯状细胞增生及黏膜下腺体肥大等病理生理变化结果［8］；哮喘发作时气道黏液分泌增多，存在MUC5AC高表达［3，6，9］。气道重塑是支气管哮喘主要病理学特性，是导致气道不可逆性气流阻塞、重症哮喘和致死性哮喘的主要病理基础。GABA是哺乳动物中枢神经系统的主要抑制性神经递质，可引起氯离子通道开放，导致氯离子流向细胞内，进而引起神经元膜发生超极化而抑制神经元。既往研究表明，哮喘发作时γ氨基丁酸A受体（GABAAR）高表达、高分泌使纤毛柱状上皮去极化状态持续存在，并诱发纤毛柱状上皮的杯状上皮细胞化生，进而引起气道重建，故推测GABAAR可能参与哮喘的发生发展过程［10］。

目前，PPAR-γ配体已被证实在炎性疾病小鼠模型中具有抗炎活性，如关节炎、炎性肠病、哮喘等［11］。PPAR-γ在肺组织中呈高表达，研究表明，PPAR-γ与激动剂结合后可抑制中性粒细胞、嗜酸粒细胞等炎性细胞功能，抑制气道上皮细胞增生，减少哮喘发作时黏液分泌，减轻气道炎性反应，进而抑制气道重塑［12］。罗格列酮为PPAR-γ高选择性激动剂，可抑制MUC5AC表达，减少气道黏蛋白分泌［13-15］。

本研究结果显示，哮喘组小鼠气道黏膜上皮局部脱落，黏膜下充血水肿，支气管壁及血管壁周围有较多炎性细胞浸润，提示哮喘组小鼠存在气道炎症及气道重塑；而地塞米松组、罗格列酮组及联合治疗组小鼠上述表现较哮喘组减轻，提示罗格列酮存在抗炎及抑制气道重塑等作用。本研究结果还显示，哮喘组、地塞米松组、罗格列酮组及联合治疗组小鼠肺组织GABAARα、MUC5AC蛋白浓度及其mRNA相对表达量高于对照组，地塞米松组、罗格列酮组及联合治疗组小鼠肺组织GABAARα、MUC5AC蛋白浓度及其mRNA相对表达量低于哮喘组；而地塞米松组、罗格列酮组及联合治疗组小鼠肺组织GABAARα、MUC5AC蛋白浓度及其mRNA相对表达量间无差异，提示罗格列酮对哮喘小鼠肺组织GABAARα、MUC5AC表达的影响与地塞米松及地塞米松联合罗格列酮相当，其可能通过下调GABAARα、MUC5AC表达而减少哮喘小鼠气道黏液过度分泌。但本研究为动物实验，且数量不足，罗格列酮治疗哮喘的具体机制仍有待更多研究进行探索。

作者贡献：吴艳梅进行文章的构思与设计，对文章整体负责并监督管理；柴雅琴、薛智文、张莉莉、吕建宁进行研究的实施与可行性分析；杜小梅、张卓红、张治国进行数据收集、整理、分析；张引亮、张栓宝进行结果分析与解释；吴艳梅、柴雅琴负责撰写论文；柴雅琴负责文章的质量控制及审校。

本文无利益冲突。