粪便和毛发取样法在麝科动物中的研究进展

索丽娟,强晓鸣,唐 婕,王 艳*

(1.陕西省动物研究所，陕西 西安 710032；2.陕西省秦岭珍稀濒危动物保育重点实验室，陕西 西安 710069；3.陕西牛背梁国家级自然保护区管理局，陕西 西安 710100)

麝(Moschus)是珍稀濒危资源动物，属偶蹄目麝科，生性孤僻，胆小机警，是亚洲的特有种。中国是世界上麝科动物最为丰富的国家[1]。麝(Moschus)包括:原麝(Moschusmoschiferus)，林麝(Moschusberezovskii)，马麝(Moschuschrysogaster)，喜马拉雅麝(Moschusleucogaster)，黑麝(Moschusfuscus)和安徽麝(Moschusanhuiensis)[2]。成年雄麝分泌的麝香是珍贵的药用材料和香料。长期以来，弥足珍贵的麝香驱动了非法狩猎活动，麝资源长期经受过度利用的巨大压力，野生种群数量锐减[3]。在持续受到人类猎杀和生境破碎化双重胁迫的情况下，国务院将麝属动物所有种列为中国Ⅰ级重点保护物种。同时，林麝被列为CITES 附录Ⅰ物种，《中国濒危动物红皮书》将麝列为濒危或易危动物[4-5]。为保护野生麝种群及可持续利用麝资源，中国科技工作者早在20世纪50年代末即着手麝类迁地保护、驯养及麝香资源的人工保育等前瞻性探索。

非损伤性取样(non-invasive sampling)是在不触及动物或低干扰动物正常活动的情况下，收集脱落的毛发或羽毛、粪便、尿液、食物残渣(含有口腔脱落细胞)、鹿角、鱼鳞和卵壳等样品[6-7]。其中收集粪便和毛发在麝科动物中应用最为广泛。本文就这两种取样法在麝科动物中的研究及应用做简要概述。

1 粪便取样

收集粪便样品无需对麝抓捕，大大降低了对它的干扰。获取的粪便样品不仅可以提取DNA进行分子生物学研究，还可以提取类固醇激素及其代谢产物，进行麝生理学研究。

1.1 粪便DNA

粪便经过肠道排出体外，其中含有大量的肠壁脱落细胞、微生物细胞以及植物细胞等，故提取的基因组DNA是各种细胞基因组DNA的混合物[8]。排泄的粪便如果没有及时收集，会导致粪便DNA一定程度的降解，进而可能降低后续PCR扩增成功率和增加基因分析错误率[9-10]。收集人工饲养麝的新鲜粪便样品比较容易，而要获取野生麝的新鲜粪便样品有一定的难度。

要减缓样品中DNA的降解，除了及时收集样品，有效的保存方法也是必须的。根据不同的研究目的，研究者保存粪便的方法也不同。Song等[11]在鉴定林麝粪样中寄生虫种类时，将收集的粪便保存在2.5%的重铬酸钾溶液中并置于4 ℃冰箱中。周美丽等[12]、王立志等[13]分别进行林麝粪便细菌、古菌多样性研究时，将获取的粪便样品-80℃超低温冰箱中冻存备用。

国内外研究者对麝类动物粪便DNA进行相关研究时，采用了不同的提取方法。结合其他物种的粪便DNA提取方法[14-16]，康强等[9]采用改良的CTAB法提取了林麝粪便DNA，进行常规PCR，能特异地扩增出mtDNA D-loop区和Cyt b基因。唐婕等[17]比较了常规试剂盒(Fast DNA SPIN Kit for fence)法和改良的试剂盒法(磷酸缓冲液处理之后，使用Biospin Cell Genomic DNA Extraction Kit)提取林麝粪便的效率，结果显示改良的试剂盒法可以显著提高林麝粪便DNA的获得率。

1.2 粪便类固醇激素

动物体内类固醇激素是一类四环脂肪烃化合物，是哺乳动物内分泌系统的内源性物质，能够有效反映机体的生理状态[18]。通过类固醇激素及其代谢物的测定可以监测野生动物或濒危物种的生殖状态和生理压力，对野生动物的保护具有重要意义[19-20]。从粪便中检测到的一般都是类固醇激素的代谢物，而不是源激素，这些物质经胆汁分泌到肠道内，通过粪便排出体外[21-24]。

研究表明，由于粪便中细菌的作用，粪便中的类固醇激素的含量会随着时间发生变化[25-26]，并且粪团表层和内部类固醇激素含量存在显著差异[27]。所以在研究中为了使试验结果更加准确可靠，应统一样品采样时间，尽量采集新鲜的粪便，并将粪样充分混合均匀。人工饲养的林麝有相对固定的排便时间和地点，为了获取新鲜的粪样，国内的研究者会在08: 00～10: 00或者更早时间进行采样[28-29]。样品采集之后通常会采用冷冻保存法保存，即采样之后，低温运送到实验室，-20 ℃冰箱冷冻保存[29-30]。郎冬梅等[28]试验比较了林麝粪样中类固醇激素及其代谢物的三种保存方法，即不作处理常温(20 ℃)保存、90%甲醇保存和加入0.9%抗生素保存，结果表明，对比抗生素保存，用甲醇保存是一种较好的保存林麝粪便类固醇激素的方法，并且不同激素(孕酮、睾酮、雌二醇等)用甲醇保存的有效时间不同。所以在实际工作中，我们应根据研究工作的条件和研究对象(激素类别)来确定保存方法。

虽然研究者提取麝类粪样类固醇激素的方法有所不同，但大都是参照Isobe等[31]和Cppezzuto等[32]的方法进行操作的，采用一定浓度的甲醇和乙醇溶液提取，用甲醇分装回收，-20 ℃以下保存，直到进行免疫测定 。

常用的类固醇激素检测方法主要有放射免疫吸附法(radioimmnoassay，RIA)[30]和酶联免疫吸附法(enzyme immunoassay，EIA)[28-29]，这两种方法各有优劣，RIA灵敏度高，但是在试验过程中会有一定的辐射。EIA相对来说灵敏度低，但是操作简单安全。具体采用哪种方法，根据研究者具体的实验条件来选择。李春等[33]在进行小熊猫类固醇激素的研究中提到，当类固醇激素样品中的甲醇浓度超过10%时，测得浓度较甲醇含量为0%时降低了27.9%～60.6%。在麝类研究中也应该考虑到所用的甲醇对检测的影响，可以尝试在样品检测前用缓冲液进行一定比例的稀释[34]。

2 毛发的非损伤取样

从毛发中提取DNA具有无创伤性、方便长途运输和简易保存、一次采样可重复性使用等优点[35]。与粪便相比，毛发采样保存比较简单，即低温冷冻保存备用。DNA主要存在于毛发的毛囊内。毛囊组织含有较多的角蛋白，所以提取毛发DNA时都需要蛋白酶K进行消化。现在从毛囊中提取DNA，普遍采用直接经蛋白酶K消化后，再用酚-氯仿多次抽提的方法或蛋白酶K消化与Chelex100 相结合的方法[36]。白康等[35]采用PCR仪法从林麝毛发中提取基因组DNA，并与传统的酚-氯仿法比较。结果表明PCR 仪法与酚-氯仿法相比操作简单，提取所得的 DNA 质量较高。

3 粪便和毛发取样法的缺点

从保护生物学角度来说，提取麝类粪便和毛发进行科学研究具有很大优势，但也存在一定的局限性。主要缺点为：(1)与血液或组织提取DNA相比，粪便和毛发获取的DNA含量低；(2)与血液提取类固醇激素相比，从粪便中获取类固醇激素的方法更复杂，步骤繁琐。

4 非损伤取样法的应用

4.1 遗传多样性研究

人工养殖林麝是林麝资源保护的一种手段。进行生物保护在很大程度上是保护生物的遗传多样性及其进化潜力[37]。由于圈养种群的奠基者数量往往比较少，长期近亲繁殖会导致种群退化、免疫力低下、成活率低[38]，故对圈养林麝种群进行遗传多样性研究，有利于制定科学的养殖管理策略，从而更加经济有效地保护林麝优良种质资源。部分研究者提取林麝毛发DNA，运用主要组织相容性复合物(Major histocompatibility complex，MHC)、线粒体控制区(D-loop区)、微卫星等分子标记对四川省和陕西省凤县多地圈养种群进行遗传多样性分析[39-42]，以便了解现有人工饲养种群的遗传多样性水平及种群间结构与遗传分化程度，从而优化林麝圈养繁育项目规划，制定合适的引种、育种策略。

4.2 疾病的研究

我国林麝养殖业发展迅猛，麝类疾病(胃肠道疾病、寄生虫病、肺炎、脓肿病等[43-45])是制约麝人工养殖业健康发展的重要因素。胃肠道疾病是由肠道微生物菌群失调引起的，研究者通过16S-rRNA高通量测序技术比较不同麝群体(健康林麝和腹泻林麝、圈养林麝与野生林麝、林麝与马麝)粪样中的肠道微生物，分析菌群多样性以及主要菌群等，为胃肠疾病诊断提供理论依据，为林麝野化放归项目研究提供参考[46-48]。而当动物体内出现寄生虫时，虫体的卵或成体可以通过粪便排出[37]。收集并提取粪便DNA，通过基因的特异性引物进行PCR扩增、序列测定和系统发育树构建等，即可以准确判断林麝寄生虫病的发生情况[49-51]。以上研究结果为胃肠道疾病和寄生虫病的防控、诊断与治疗提供了理论依据和新的视角。

4.3 应激反应监测

应激(stress)是机体对外界或内部各种刺激所产生的非特异性应答反应的总和，是机体应对各种生存胁迫因子而产生的一种生理适应[52]。应激水平的高低主要通过皮质醇激素浓度来反映。He等[53]研究发现越是拥挤环境中的雌性林麝粪便皮质醇浓度越低，说明长期的拥挤影响了林麝的应激状态。在人工养殖过程中，应该考虑林麝对空间的需求。非孕期圈养林麝皮质醇激素的测定结果表明，雌性林麝在幼仔卧巢哺乳期、幼仔出巢哺乳期、幼仔单独饲养期、发情期四个不同阶段，皮质醇水平会呈现一定的波动规律，且第一阶段处于较高的应激水平，应以雌麝的管护为主[39]。李琼[54]研究发现原麝皮质醇水平与睾酮和雌二醇水平呈显著相关性，说明生殖压力会使动物产生应激反应。因此，粪便类固醇激素水平的测定可以做为评估麝科动物管护和科学实验中所遇到的各种刺激的一种有效手段。

4.4 卵巢功能和妊娠监测

Mithileshwari等[55]通过EIA测定了马麝三种孕前激素，发现测定交配后前三个月的孕二醇-3葡糖苷酸(PdG)水平是监测妊娠的有效手段。Wang等[56]通过对林麝孕酮水平的测定可知，林麝的发情周期为24.3±0.5 d，黄体间期为21.6±0.5 d，黄体期为2.7±0.3 d；林麝在妊娠2 w后粪便中孕酮浓度迅速增长，其浓度远远大于非孕期。故监测粪样中的孕激素水平是评估林麝卵巢功能和监测妊娠的有效方法，将有助于提高圈养麝的繁殖率，并可用于监测野外麝的繁殖状况。

5 展 望

综上所述，粪便和毛发取样法在麝科动物健康状况的评估、适应性测定、遗传多样性、生殖生理监测等方面的应用显得日益重要。

就麝科动物而言，粪便和毛发取样法主要应用在人工养殖群体中，在野外种群追踪调查研究中涉及较少。2017年6月29日，13只经过野化训练的人工繁育林麝在位于秦岭深处的陕西省宁陕县响潭沟正式启动野化放归。放归后，陕西省动物研究所科研人员利用GPS项圈、自动感应红外相机技术等，对回归自然的林麝进行监测和野外巡护。建议结合粪便和毛发取样法来了解它们的生境选择、活动规律、繁殖状况、疾病与寄生虫、种内与种间关系，为更大规模的野化放归提供科学依据。

与其它物种相比，粪便和毛发取样法在麝科动物的应用还不够广泛，还未涉及到雄性繁殖能力评估、性别鉴定、亲缘关系的鉴定等方面。相信随着越来越多研究者进行麝科动物科学研究，该方法会不断完善、推广和普及。