建立大鼠心脏死亡供体原位肝移植模型方法的研究进展

武睿超，黄兆宇，张 黎，刘钧汉，郑克谱，冉江华

(昆明市第一人民医院肝胆胰血管外科,云南 昆明 650500)

肝脏移植手术是终末期肝病患者唯一有效的治疗措施。然而供体短缺已经成为了制约肝脏移植发展的瓶颈[1]。在这样的环境下，心脏死亡供体(donation after cardiac death，DCD)成为了获取人体器官的重要途径，也缓解了供肝短缺的问题。由于DCD通常都会经历一定时间的低血压及低氧饱和度，随之而来的便是延长的热缺血时间对移植物功能的影响。热缺血时间是衡量热缺血损伤最直接的标志，热缺血时间延长会继发术后原发性移植物无功能和胆道狭窄等并发症[2]， 增加了患者接受DCD 肝移植术后的风险。因此，研究DCD肝移植的相关问题具有重要的现实临床意义和价值。而建立稳定的大鼠DCD原位肝移植模型是研究DCD肝移植的基础。目前关于大鼠原位肝移植模型的研究很多，但关于大鼠DCD原位肝移植模型的研究却很少，且大鼠DCD原位肝移植的建立，步骤多，操作复杂，难度较大。该文就建立稳定的大鼠DCD原位肝移植模型的各个环节进行综述。

1 大鼠

用于研究DCD肝移植的实验动物中，各项条件与人类最相近的是恒河猴，但考虑到其高昂的价格，运用较少。一些研究也用猪、兔、狗和豚鼠做原位肝移植的研究，相比之下，选用大鼠建立原位肝移植模型更经济实惠，可重复性强，技术更成熟。一般选择体重为250～300 g的雄性SD大鼠或者Wistar大鼠，这两个品种的大鼠生长发育快，抗病能力强，自发肿瘤率低，对性激素感受性高。也有使用近交系的Lewis大鼠，相比前两者，Lewis大鼠排斥反应弱，但抗病、抗感染能力较弱，也更贵。若研究急性免疫排斥，国际上公认的鼠种配对方式为型 DA 至Lewis 大鼠、DA 至 Brown Norway大鼠及 Brown Norway至 Lewis 大鼠，国内由于上述鼠种缺乏及技术操作尚待改善，目前较多应用的鼠种配对方式 Wistar 至 SD大鼠， Lewis 至 Wistar 或者SD大鼠至Lewis大鼠[3]。

2 手术麻醉

文献中建立大鼠DCD肝移植模型常用的麻醉方法有水合氯醛、戊巴比妥注射麻醉，乙醚吸入麻醉。戊巴比妥钠和水合氯醛对动物的体温、呼吸、心率均有一定程度的抑制，但水合氯醛对动物呼吸频率、体温及心率的影响较小。大鼠DCD肝移植外科操作复杂，时间要求较长，水合氯醛腹腔注射是很好的选择，其诱导时间短，维持时间长，价格低廉，较易获得，麻醉过程中动物痛苦较轻，苏醒期较平稳，安全性好[4]。也可选择间断注射麻醉[5]，即术前间断小剂量给药直至达到麻醉状态立即停药，术中根据手术时间和大鼠麻醉深度给予补充注射麻药。该方法可避免部分对麻醉药物敏感的大鼠因常规剂量的注射而造成的死亡，降低动物的麻醉死亡率。戊巴比妥钠麻醉后恢复期长，恢复期过长可导致大鼠术后死亡，而且其具有肝毒性，不建议使用。乙醚吸入麻醉简单易行，诱导期短，可根据大鼠的呼吸频率、深度等随时调整吸入剂量，根据手术时间的长短调整麻醉时间，且撤出麻醉迅速，术后较易苏醒，而且对肝功能、生理影响较小,无肝期开始后死亡率低。受体手术中进入无肝期以后动物有一种类似于“休眠样”的状态，在完成肝移植开通肝血流后,这种状态还能维持10 min左右[6]，乙醚麻醉则可在进入无肝期后撤除麻醉，防止麻醉过深术中出现呼吸心跳骤停或者术后苏醒困难。乙醚和水合氯醛的缺点是会导致呼吸道分泌物较多，术前给大鼠注射阿托品后呼吸道分泌物明显减少，可避免呼吸不畅导致的术中和术后并发症。DCD的供肝较无DCD的供肝损伤重，移植肝复通血流后恢复功能较慢、较差，术后转醒时间也较长，有条件可给予吸氧。麻醉时应适当减少麻药剂量，在开通肝血流后出现大鼠苏醒过早，可用小剂量乙醚吸入补充麻醉。

3 术前准备

供体术前不禁饮食，可根据需要于术前5～10 min静脉注射肝素，由于大鼠肝脏经历了一段时间的血流中断，肝脏血管易形成凝血，血栓栓塞，影响灌注效果，术前供体全身肝素化有利于DCD供肝的保护。也有实验的模型为了更接近临床DCD肝移植，术前不使用肝素。

受体术前禁食6～8 h，期间可给予糖水供能，禁水2 h，以保证其胃部空虚，防止呕吐及误吸，提高手术的安全性，也利于术中视野的清晰暴露。若选择水合氯醛或乙醚麻醉，受体术前30 min 皮下注射硫酸阿托品减少呼吸道分泌物。供体术前给予抗生素和糖皮质激素能显着提高移植成功率和术后生存率[7]。临床肝移植中，免疫抑制治疗和抗感染治疗是重要的组成部分。糖皮质激素作为最早使用的免疫抑制剂，曾经扮演着不可或缺的角色，糖皮质激素具有抗炎、免疫抑制、抗微生物毒素和抗休克作用，在大鼠肝移植手术中使用可增强手术耐受力和术后生存率。激素免疫抑制治疗相比于非激素免疫抑制方案而言，其最大的弊端是免疫力下降，感染发生率增加[8]。加之动物手术很难做到完全无菌操作，供体术前给予注抗生素抗感染很重要。

4 热缺血时间

目前普遍认为肝脏安全承受热缺血时间的上限为30min。在大鼠DCD肝移植模型中，热缺血30min内肝损伤可逆，并逐渐恢复正常结构和功能，移植物存活率无明显差异[9]。热缺血延长到45 min时微循环功能还可耐受，热缺血60min时微循环出现不可逆功能障碍[10]。超过30 min热缺血，则可能导致肝脏微循环障碍、PNF、胆道缺血性损伤等并发症发生率显著增高，移植成功率大大降低。在模型建立时，应根据实验目的选择合适的热缺血时间。Monbaliu D等[11]发现在大动物DCD模型中，在热缺血60min后通过常温体外机械灌注取代4h的冷缺血时间，可明显减少移植物原发性无功能的发生率。若具备常温机械灌注设备，可延长模型热缺血时间。

5 保存液

DCD肝脏遭受更为严重的热缺血损伤，从而易引起移植后移植物功能延迟恢复、移植物原发性无功能、微循环障碍和胆管性病变。供肝的灌注和保存效果直接影响供肝的质量。而供肝质量直接关系到模型建立是否成功和术后存活率。选择保存液显得十分重要，器官保存液应具有降低移植物水肿、细胞内酸中毒、氧自由基以及提供能量底物的功效。威斯康星大学保存液(University of Wisconsin solution,UW)、组氨酸-色氨酸-酮戊二 酸盐液(Histidine Tryptophan Ketoglutarate solution,HTK)是目前国际上应用最广泛的冷保存液，动物模型中也经常使用，但二者的保存效果目前仍然存在争议。UW是目前供肝灌注及冷保存的金标准保存液，但对于DCD供肝而言，热缺血时间的延长可导致肝窦状隙和微循环灌注不足，高钾及高黏度的UW可使遭受冷热缺血损伤的肝脏微灌注不良进一步加重，可能损伤内皮细胞，从而导致血管收缩，供肝灌注不均匀。李涛等发现在冷保存 8h 的条件下HTK对大鼠DCD供肝的保存效果优于UW，可能与其更好的灌注并减少内皮细胞与 Kuuffer细胞的激活有关，但延长冷保存时间后，HTK的优势消失[12]。Juang SE 等[13]发现，UW虽含有较高的钾，但在活体肝移植中对血清钾含量的变化无负面影响，HTK和UW液都能使患者血钾维持在正常范围。Stewart ZA.等[14]的研究发现HTK保存与DCD供肝移植物存活率下降有关，尤其是冷缺血时间>8 h的移植。Mangus RS等[15]则发现两种溶液对供肝短时间的保存效果相似，肝移植术后生存率无明显差异，但HTK对于胆道的保护优于UW，且HTK的价格相对更低。其他保存液如Collins液, Institute georges lopez 1 液，Leeds solution、Polysol液和Celsior液等偶尔也有用于动物模型。乳酸钠林格氏液和生理盐水因为价格便宜，容易获得被国内很多研究广泛使用，但其降低移植物水肿、细胞内酸中毒、氧自由基以及提供能量底物的功效差，不能长期保存供肝。所以若选择乳酸林格氏液作为保存液，应尽量缩短冷缺血时间。此外保存液中加入肝素、糖皮质激素、葡萄糖酸盐、抗生素、碳酸氢钠、全氟碳化物、血管活性药物和充氧等可以增加建模成功率[16-20]。

6 灌洗保存方式

模型灌洗主要采用物理灌洗[21]，即待到设定的热缺血时间时，自灌洗流入道主动脉或者门静脉进行穿刺，也有采用主动脉门静脉双重穿刺，同时剪开肝上下腔静脉胸段作为流出道，0～4℃保存液开始灌洗。自主动脉灌洗操作简单，容易控制，被较为广泛地运用。灌洗速度控制在3～4 ml/min,灌洗压力不可过大，防止造成肝水肿，肝血窦结构破坏。持续灌洗至肝脏颜色黄白、质地均匀。

保存方式目前有静态冷保存(Static cold storage，SCS)和机械灌注(Machine perfusion，MP)两种方式。SCS是模型目前肝脏保存应用最广泛的方法，即使用0～4℃保存液浸泡保存即可，具有设备简单，操作便捷，价格低廉等特点。但也有一定的劣势应予以重视，如SCS过程中会导致肝脏血管张力改变、肝窦内皮损伤，细胞水肿、酸中毒等损伤，过长冷保存可以引起胆道并发症、移植物肝功能恢复延迟或者失功能甚至受体死亡[22]。若模型需要模拟临床上供肝存在保存运输的冷缺血时间，理论上UW液可保存供肝20～24h，但SCS过程中存在冷保存损伤。模型中SCS理想的供肝冷保存时间不超过8h，保存时限一般不超过12～15 h[23]。不同于 SCS，机械灌注技术通过连续动态灌注保存液，实时监控血管阻力、灌注压、灌注液生化指标等参数来动态评估肝脏活力的同时，输送养分供给，保证肝细胞的正常生理代谢，能够减少低温、缺氧对肝细胞的损伤。持续灌注能够有效减少代谢废物在肝脏的堆积，减轻肝细胞遭受毒性损害等,实现肝脏保存与修复，显著降低移植后移植物功能延迟恢复和移植物原发性无功能的发生率[24]。使用机械灌注可延长肝脏的保存时限，并且恢复经过热缺血损伤的肝脏的部分功能，有助于提高模型建立成功率。但机械灌注受压力、灌流速度、氧合情况等参数综合影响，且设备昂贵，操作复杂，使用较少。

机械灌注根据灌注过程中维持温度不同又可以分为低温机械灌注(4℃ ～6℃)、亚低温机械灌注(20℃)和常温机械灌注(32℃～37℃)[23]。目前关于灌注温度选择存在争议。低温机械灌注可以降低器官代谢速率，降低缺血损害。一些研究[25-26]报道了低温机械灌注在 DCD供肝中的保护性作用。其核心技术在于压力控制，而非流量控制，因为低温环境下，微循环毛细血管床收缩，较高压力波动直接损害器官[27-28]。Bruinsma BG等[29]的实验则论证了亚低温机械灌注对肝脏保存效果的优越性。与此同时，也有大量研究支持常温机械灌注提供最接近生理状态的局部环境，能更好地保存和修复肝脏功能，延长热缺血耐受时限，将供肝原发性无功的风险降至最低，有效提高利用率[30-32]。而且对于DCD供体而言，胆道并发症风险较高[33]，Op den Dries S等[34]分别使用常温机械灌注及SCS，保存大鼠DCD供肝及非DCD供肝3h，结果证实，常温机械灌注在DCD供肝中能减少胆道损伤。

7 手术操作

目前大鼠原位肝移植的手术方法最成熟也最经典的是Kamada N等[35]创建的“二袖套法”[36]，即肝上下腔静脉用缝合法吻合，门静脉和肝下下腔静脉用袖套法吻合,胆总管采用单管内支架胆管。缩短无肝期是建立大鼠原位肝移植模型成功的关键[37-38]，该方法快速重建门静脉以及肝下下腔静脉，将无肝期缩短到15～20 min，术后存活也得到了提高。但是，这种方法仍需缝合肝上下腔静脉，需要一定的外科基础，掌握袖套技术也需要一定的时间。Miyata M等[39]的“三袖套法”，即在二袖套法的基础上将肝上下腔静脉改为袖套法吻合，使无肝期缩短。然而，这种方法容易出现肝上下腔静脉扭曲以及错位，造成肝上下腔梗阻。Engemann R等[40]发展完善了吻合肝动脉的大鼠肝移植模型，吻合肝动脉更符合生理要求，能有效地降低胆瘘、胆道梗阻等并发症，但无肝期较前二者延长。近年来，有研究者在二袖套法的基础上，运用磁环的磁力、三维空间自动重合特性将供受体的肝上下腔静脉对合[41]。这种方法可以缩短无肝期，降低手术难度，并且保持肝上下腔静脉较高的通畅率，改善组织的愈合，提高大鼠肝移植模型术后存活率。手术操作的关键在于简化操作，缩短无肝期，无肝期不应超过26min[35]。后续关于大鼠原位肝移植模型的研究多是在以上手术方法的基础上进行改良完善。大鼠DCD原位肝移植模型还需要在大鼠原位肝移植模型的基础上模拟DCD供肝热缺血过程。目前临床上热缺血时间普遍定义为功能学热缺血[收缩压持续(至少2 min)低于50 mm Hg(1 mm Hg=0.133 3 kPa)，10 mm Hg或血红蛋白氧饱和度低于70%]开始直至冷保存液开始灌洗的时间间隔[23]。目前大鼠模型制造热缺血，原理在于阻断肝脏血流。具体方法有用血管钳夹闭供体大鼠心脏基底部致使心脏停搏或者阻断胸主动脉和膈上下腔静脉，有的实验中还会同时切断供体大鼠气管。受体大鼠手术中还应注意尽量缩短手术时间，减少手术损伤和出血。

8 术后监护

经历热缺血的原位肝移植的大鼠较无热缺血原位肝移植的大鼠肝功能差，模型建立是否成功，术后的监护仍然很重要[21]。首先可根据阴茎背静脉充盈程度给予适量补液，补充的液体可加入少量碳酸氢钠以纠正酸中毒，补液宜适量，注射速度缓慢，防止发生充血性心力衰竭和肺水肿。术后应注意给大鼠复温保暖，防止低体温引起死亡。连续吸入氧气可促进麻醉清醒，等其完全清醒并可以照常活动后，置入单笼喂养1 d，当日饮用葡萄糖。次日标记后与其他动物合笼，正常饮食。术后前3天可予注射糖皮质激素和抗生素。若要采血检测，则需进行采血后补液。

综上所述，在大鼠DCD原位肝移植模型的建立中，存在热缺血损伤供肝的质量好坏是模型建立成功与否的关键。需要研究者特别注意选择与自己研究合适的热缺血时间，在供肝灌洗和保存中尽量维护肝脏功能。模型建立的难点在于手术操作，需要研究者长周期的手术训练，尽量缩短无肝期，能提高术后存活率。而大鼠、手术麻醉、术前准备、术后监护等环节的选择和处理也都关系到大鼠DCD原位肝移植模型是否能成功建立，需予以重视。进一步的研究需要关注灌注液开发、供肝保存方式，手术操作等核心的、有争议的问题，为推进大鼠心脏死亡供体原位肝移植的研究提供实验依据和优化方案。

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