微环境对牙髓血运重建的影响研究

梁 倩，于凤麟，赵月萍

(1.暨南大学口腔医学院，广东 广州 510632；2.暨南大学细胞生物系/生物医药研究院，广东 广州 510632)

牙髓组织是包括有各种细胞，纤维，血管，神经的一个完整的器官组织。当恒牙发育期间受到创伤、炎症等引起牙髓感染坏死时，会使牙根发育停止，此时患牙牙根短，冠根比例不协调，根部牙本质壁薄弱易折裂等，在口内的使用质量和寿命都将受到影响 。传统的治疗方法是根尖诱导术，通过根尖屏障使根尖孔闭合。不过存在部分患牙牙根不能继续发育，牙根短、根管牙本质壁薄受力易折等不足，牙髓血运重建术(revascularization)可以弥补根尖诱导愈后的不足，并有可能再生牙髓-牙本质复合体。

牙髓血运重建术有三大关键因素：控制感染 、形成血凝块与封闭冠部。通过此三步操作形成了一个牙髓腔内细胞赖以生存的环境，即“微环境”，直接影响到血运重建术的成功与否。如果发生根管再感染，或者血凝块形成不足，牙髓微环境重建不善会导致血运重建术的失败[1-2]。牙髓“微环境”，通俗的讲就是指牙髓内细胞生存的微观环境，包括细胞外基质以及其中的一些体液成分。只有稳定的微环境才能保证细胞/干细胞的正常增殖、分化、代谢和功能活动。牙髓腔内的多种细胞、神经、血管，淋巴和结缔组织共同组成了牙髓，其再生的能力取决于干细胞或祖细胞的潜能和微环境的影响。创伤或感染破坏牙髓组织微环境的平衡，干扰干细胞增殖分化，促进干细胞凋亡，最终导致牙根停止发育。血运重建术基于创造一个利于干细胞生存的无菌的微环境的理念，通过刺激根管内出血形成血凝块，利用干细胞归巢作用诱导根尖周组织的干细胞进入根管，在生长因子和血凝块等搭建的微环境内使得干细胞增殖分化，促进组织新生，最终达到牙髓再生的目的。但是血运重建术只能得到类牙髓样组织，没有真正意义上的牙髓组织[3]。随着生物技术发展和医疗手段的进步，血运重建术从引导组织再生(guided tissue regeneration,GTR)向采用组织工程(tissue engineering)技术发展，以期获得具有完整组织功能的牙髓，这也是目前再生性牙髓治疗(regenerative endodontics procedures，REPs)的发展方向和研究热点。本文查阅了近10年血运重建术的报导，综述了微环境在血运重建术中的重要作用，并对牙髓再生新技术进行了展望。

1 血运重建术的发展历程

早在二十世纪六七十年代，Ostby首次利用血凝块促进根管愈合[4]。他对牙髓坏死的年轻恒牙，用4%甲醛消毒，刺激根管出血，形成血凝块，术后随访患牙的临床症状消失，影像学检查根尖孔闭合。1966年Rule和Winter考虑到根管内感染为厌氧菌为主的混合感染，采用多联抗生素(多粘菌素B硫酸盐、硫酸新霉素、杆菌肽、制霉菌素)和可吸收的碘仿汇合控制根管感染，但不刺激根管出血，文章报导了5个案例，只有1例牙根继续发育，有4例没有成功。1996年Hoshino首次提出采用三联抗生素(triple antibiotic paste，TAP)来控制根管感染，通过药敏试验和细菌复苏实验，对不同浓度TAP的抗菌性能进行研究，结果发现TAP在20 μg/ml、50 μg/ml时，细菌数目为零。2000年Iaway 报道了现代血运重建的病例，对于牙髓坏死的年轻恒牙不预备根管，仅用大量5%NaClO和3%H2O2冲洗根管，然后根管内封两联抗生素(double antibiotic paste，DAP)来控制感染，6周后发现根管口有牙本质桥的形成。随后用玻璃离子和树脂双层充填。30个月后的随访显示髓室和根管的空间减小，治疗获得成功。此后血运重建操作不断完善和规范，2001年至今pubmed输入“pulp revascularization”检索有212篇文献报道，表明血运重建得到了广泛的认可和应用。2013年学者Diogenes首次提出了标准操作流程，经过临床不断探索 修正和完善，美国牙髓病协会(American Association of Endodontics,AAE)于2013年发布了完整的操作指南，目前最新为2016年版。

血运重建为牙髓坏死的年轻恒牙提供了新的治疗思路，大量的动物和人类研究证实它使得牙根继续发育，牙根增加长度和根管壁增加厚度，相比较于根尖诱导和根尖屏障术来说，是目前最好的治疗手段，但是它也有失败的案例，比如血凝块形成不足导致的失败，术后根尖未继续发育等问题[1，2，5]。因此如何提高血运重建的成功率是我们亟待解决的问题。

2 无菌的微环境和组织再生

血运重建术简单分为以下三个操作：①清理感染牙髓：不预备根管，大量有效的根管冲洗，干燥后根管封抗菌药物，然后冠部封闭；②检查患牙无症状，用小号锉超出根尖孔，刺激根尖周血液进入根管，然后冠部严密封闭，以防微渗漏；③随访及预后评估，其中的感染控制和冠部封闭为牙髓腔创造了一个无菌的微环境。

组织再生必须是在感染控制下的微环境内才能发生，因此对于牙根未发育完全的年轻恒牙，感染控制和冠部的封闭非常有必要。未发育完成的年轻恒牙主要通过化学消毒和根管封药来控制感染，不建议根管预备，因为预备根管不仅会继续削弱薄的牙本质壁，增大受力根折的风险；还会破坏存在于根尖区的干细胞，清除掉参与再生过程中分泌重要的生长因子的组织成分[6]。根管常用的冲洗液是次氯酸钠和乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)，TAP/DAP和氢氧化钙(calcium hvdmxide，CH)是根管内常用封药。

次氯酸钠是目前临床使用最多的一种根管冲洗剂，能够较强地溶解牙髓坏死组织和根管玷污层中的有机物，推荐的使用浓度从0.50%～5.25%不等，其浓度与细胞毒性正相关。Asrary体外研究不同浓度次氯酸钠过牙髓细胞活性的研究发现当次氯酸钠的浓度由0.04%上升至0.08%，细胞活性下降30倍，因此他认为高浓度的次氯酸钠对干细胞有细胞毒性[7]。另一对1.25%次氯酸钠冲洗液和TAP的研究发现，仅用1.25%次氯酸钠冲洗根管只有10%的根管无菌，而根管封药TAP两周后，剩余90%的根管里细菌为0[8]。这说明了根管内起到抗菌主要作用的是TAP，因此在考虑尽可能地保持干细胞的活性情况下，可以选择低浓度的次氯酸钠大量的冲洗。

EDTA是一种强效螯合剂，可与次氯酸钠溶液联合使用。17%的EDTA冲洗剂不仅可以去除牙本质中的有机物和无机物，以及牙髓组织中的部分无机物成分，还可清除牙本质玷污层并开放牙本质小管，提高冲洗剂及根管内封药的疗效，还可以使促进细胞募集，增殖分化的细胞释放细胞因子，提高再生治疗的成功率[9-11]。Asgary研究证实5.25%次氯酸钠对干细胞有毒性，但是17%EDTA可以起到诱导干细胞存活的作用[7]。Galler研究了次氯酸钠和EDTA对牙本质小管的作用，实验分两组，一组只用6%的次氯酸钠清理牙本质，一组6%的次氯酸钠和17%EDTA联合使用。DPSC接种到含有生长因子和处理过的牙本质壁的水凝胶，植入免疫缺陷鼠的皮下，六周后免疫组化结果示：单独次氯酸钠组牙本质璧上可见吸收间隙，而联合组可见细胞表面与牙本质壁亲密接触，细胞突起延伸至牙本质小管内和牙本质细胞样表型表达[12]，说明了17%EDTA可以逆转次氯酸钠对干细胞的毒性作用。

根管封药以控制感染但不损伤干细胞活性为目的，常用的药物是TAP/DAP或CH。Sabrah体外实验研究了不同浓度TAP和DAP的抗菌性和细胞毒性作用，分别对粪肠球菌建立的细菌生物膜和牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)处理3 d，结果显示TAP、DAP在浓度为10、1、0.5、0.25、0.125 mg/ml时，均有抗菌作用，但只在0.125 mg/ml对DPSC无细胞毒性作用[13]。AAE推荐的使用浓度为0.01～0.1 mg/ml[14]。CH同样是根管封药选择之一。2012年Chen研究20例牙髓坏死的年轻恒牙封药CH血运重建的效果，其中平均随访时间19.6月内15例患牙影像学显示牙根得到进一步发育，证实氢氧化钙对根尖乳头干细胞无毒性。2015年 Galler KM[10，12]报道指出EDTA冲洗根管后再使用CH对生长因子的释放起到积极作用。

但是，TAP或CH也各有不足，研究证实米诺环素引起牙体变色，可用阿莫西林、克林霉素等替代。TAP还存在对干细胞的毒性[10]、诱导耐药菌株产生、发生过敏反应等和降低牙本质机械性能等不足[15]。学者研究CH易被炎症吸收、形成不规则钙桥和破坏牙本质胶原纤维易引起根折等缺点[16]。

冠部封闭常采用双层或者三层封闭，以防微渗漏引起根管再感染造成治疗失败[17]。常选择生物相容性好的材料如三氧化物聚合体(mineral?trioxide?aggregate，MTA)覆盖血凝块上。鉴于MTA会引起牙变色，新一代的生物陶瓷材料，主要成分包括氧化锆、氧化钽、磷酸二钙、硅酸钙等，可以完善封闭根管系统与其周围组织的交通支，与周围组织相容性好适用范围与MTA 相同。

由上可见，不同种类和不同浓度的冲洗试剂和抗生素可以控制感染，为细胞营造一个无菌的环境外，还可以影响干细胞/细胞的活性。此外在感染环境下牙髓腔内还会有产生系列的炎症因子。

最近的证据表明[18]，感染对于组织创伤修复是把双刃剑，炎性反应初期刺激受损组织释放信号因子，使大量干细胞聚集在受损部位，促进组织自我修复；随着炎性反应的发展，组织再生受到限制。在牙髓炎早期，炎性反应水平低，细胞因子处于相对低的浓度水平，该浓度下的促炎因子如肿瘤坏死因子(tumor necyosis factor，TNF)、活性氧类(reactiveoxygen species，ROS)，能上调某些信号通路如P38MAPK 信号，促进干细胞分化和矿化过程，以及牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein，DSP)和牙本质磷蛋白(dentin phosphor protein，DPP)的表达[19]，随着炎症的发展，干细胞长期暴露于炎症信号分子，如TNF-α、IL-1、IL-6等，破坏了干细胞的微环境，干扰干细胞增殖、分化能力，甚至引起干细胞凋亡，导致牙根的发育停止[3]。

3 根管内微环境与血凝块

当患者第二次复诊，患者症状消失，生理盐水去除根管抗生素封药，17%EDTA荡洗根管，纸尖干燥。选择10号K锉出根尖孔，刺激根尖周组织出血，使血液进入充满根管至釉牙骨质界下3～4 mm,血凝块凝固需要15 min。

2015年，Park报道两例血运重建不成功的病例：①病例一：患者男，8岁，诊断右下颌第二前磨牙牙髓坏死伴根尖周脓肿，根尖片示：根尖孔开放，根尖周有较大的低密度影。考虑根尖孔开放，经患者及家属知情同意，对患牙做血运重建。首诊2%的利多卡因(含1∶100,000肾上腺素)局部麻醉，橡皮障隔离，5.25%次氯酸钠冲洗和生理盐水冲洗根管，封TAP(甲硝唑+环丙沙星+阿莫西林1∶1∶1生理盐水调拌)Cavit暂封。三周后复诊，患牙无症状，去封，生理盐水冲洗，17%EDTA荡洗根管。纸尖干燥，10号K锉出根尖孔刺激出血，MTA封闭，放置湿润的小棉球，暂封，1 d后取出棉球，复合树脂充填。随访1年观察：患牙无症状，根尖周阴影消失，根尖孔闭合，可见牙周膜间隙。但是未见牙根继续发育。②病例二：患者女，20岁，右下颌第二前磨牙诊断牙髓坏死的根尖周脓肿，根尖片检查根尖孔开放，根尖周低密度影。处理同上，1年后随访检查根尖孔关闭，可见牙周膜间隙，但是牙根未见增长，根管壁未见增厚。

上述病例一失败原因可能是形成血凝块不稳定，MTA挤压血凝块过多根管空间，根管内血凝块的不足限制了牙根的进一步发育。病例二的原因是根尖孔的直径小血凝块形成不足。由上述案例报导可见血凝块的形成及性状在血运重建术中起到了非常重要的作用。血凝块实际上是一个含有大量生长因子、吸引干细胞募集的三维支架，维持了干细胞增殖、生长和分化所需要的微环境，对牙髓再生意义重大。

血凝块的形成与两个因素有关，一个是要选择不含肾上腺素局部麻醉药物，另一个是患牙根尖直径至少>1.1 mm或1.5 mm[20-21]，根管口>3.2 mm[22]或<0.8 mm[23]无法得到足够并稳定的血凝块。在血凝块上放置胶原水凝胶等可以帮助固定血凝块。Jang研究了胶原膜对宽大根管血运重建的作用，将46个根尖孔均>2 mm的患牙分为两组，试验组在根中1/3处血凝块上放置Bio-Gide胶原膜，其上再放MTA，对照组只在根中1/3血凝块上放MTA。平均随访时间8～28个月，发现放置胶原膜的根中1/3牙本质壁的厚度有统计学差异，表明胶原膜稳定了宽大根管血凝块的定位，促进牙本质的发育[24]。

血凝块形成后，诱导了根尖周血管内干细胞向血凝块迁移，并募集在血凝块周围，此现象被称为干细胞归巢(stem cells homing)。这些募集的机体自身干细胞都不同程度地参与了创伤愈合和组织再生的过程。血凝块也可以认为是一个干细胞龛(stem cell niche)，包含有各种复杂成分如其他的干细胞、基质细胞、免疫细胞、生长因子、黏附因子等其他活性因子、细胞外基质和神经纤维等。2011年Lovelace等发现刺激出血后根管内有CD105、CD13、STRO-1高表达的干细胞，他们认为这些干细胞来自于根尖周组织，进入根管的血液中干细胞的含量是根尖周血液的700倍[25]。研究发现位于根尖周血管周围的干细胞有：根尖乳头干细胞(stem cells form the apical papilla,SCAP)，牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs))，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)，还有根管残髓里的DPSCs。Hargreaves证实进入根管的干细胞主要是SCAP[26]，不过因为根尖孔敞开的解剖结构，也有PDLSCs和BMMSCs[26]进入根管。另外动物实验证实即使牙髓坏死的根尖周病变，根管内也还有部分牙髓有活力，这些组织中含有的DPSCs血运重建后继续存在根管内，易被误为真正的牙髓再生[27]。

干细胞的分化与所处的微环境密切相关。如果干细胞离开了特定的龛，其生物学行为将由新的微环境改变。因此干细胞的分化与所处的微环境密切相关。血凝块形成后，含有大量的生长因子，如血小板衍生生长因子(plateletderived growth factor，PDGF)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)。它在创伤修复的早期可以促进血管愈合并招募干细胞促进其增殖，但不参与干细胞的分化[28]；PDGF可以促进根尖牙乳头干细胞的增殖，同时能促进细胞外基质的表达，还能提高细胞耐受凋亡的能力，PDGF还可以促进体外培养的牙乳头干细胞增殖，抑制其碱性磷酸酶(alkline phosphatase，ALP)的活性，即PDGF可能参与调节根尖牙乳头干细胞向成牙本质细胞的分化。另一方面牙本质基质也释放了大量的生长因子：如转化生长因子beta 1(transforming growth factor beta 1,TGF-1)、骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP - 2)或成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2，β-FGF)[29-30]。 这些因子是间充质干细胞向牙本质细胞分化参与牙本质形成的重要调控因子。其中BMP-2可以调节干细胞的牙源性分化，促进新生基质的矿化。VEGF对SCAP或DPSCs牙源性分化能力起协同作用[31]。对牙本质壁表面进行清理，可促进牙本质基质中生长因子的释放[32]。

大多数的动物和人类实验强调了血凝块的重要性是因为血凝块里含有的细胞基质、纤维蛋白、趋化因子和生长因子等，共同构建了一个干细胞向牙髓样组织分化的微环境。 因此血运重建能否创建一个有益于干细胞分化成牙髓样组织的微环境是血运重建术成功的重要影响因素。但遗憾的是目前大量的组织学研究证明新生的组织主要是类骨样，类牙骨质样或类牙周样组织，没有明确的研究显示形成了类牙髓组织[27，33]。

为得到完整组织结构和功能性的牙髓组织，组织工程技术被引进到牙髓再生领域。搭载或未搭载有干细胞/细胞的三维支架材料，复合或未复合生长因子和趋化因子，被植入到牙髓腔内诱导牙髓组织的形成。目前支架材料分来天然材料、人工合成材料和复合材料。天然材料如血小板富集血浆(PRP)、胶原、壳聚糖、血凝块等，它们具有良好的生物相容性和生物降解性。Bezgin研究发现，浓缩血小板丰富的血浆 (cPRP)在治疗根尖病变和开放性顶点时有重要作用[34]。在临床实际操作中，还存在根管无出血的情况，在没有血凝块形成的情况下可用富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)或富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)代替血凝块，也能达到同样的治疗效果[35]。Bezgi报道了使用富集血小板血浆(platelet-rich plasma，cPRP)治疗牙髓坏死的未成熟牙齿治疗的两个病例，12月后随访患者无症状，影像学显示牙根进一步发育，作者认为cPRP用于成功治疗牙根未发育完成的根尖病变的血运重建的支架材料[36]。另有病例报道指出，PRP支架的治疗可以改善和加速未发育完成的牙根的进一步发育[37]。目前很多病例报道和动物实验研究PRP和PRF代替血凝块支架，Mittal[37]认为两者支架都可以加速组织的新生，Narang[38]研究认为PRF在根尖孔闭合和增加根长和根管壁厚度方面较PRP和血凝块好。人工合成支架主要是丙交酯乙交酯共聚物，如聚乙交酯、聚L-丙交酯或两者的共聚物。常用的还有羟磷灰石-磷酸三钙和釉基质蛋白。

生长因子则诱导促进干细胞增殖和分化。大多数生长因子通用并可刺激干细胞分化，部分具有特异性，专门帮助诱导分化某些特定的细胞类型。牙本质牙髓再生研究涉及的生长因子主要有TGF、BMP、VEGF、FGF和牙本质基质蛋白等。干细胞根据其来源分为牙源性和非牙源性。牙源性干细胞主要有以下五种：DPSCs、SCAP、牙胚细胞(germ cell)、乳牙干细胞(stem cell form human exfoliated deciduous teeth,SHED)和牙囊干细胞(dental follicle progenitor cells,DFPCs),其中牙髓干细胞最为关注，研究证实SCAP更适合用于以细胞为基础的牙髓再生，尤其是进行以再生牙根为目的的牙髓再生。将体外扩大培养的DPSCs、SHED和SCAP通过支架分别植入大鼠皮下和猪的牙槽窝中，有牙本质牙髓复合物(dentin-pulp?complex，DPC)形成[39-40]；非牙源性干细胞主要有BMMSC、胚胎干细胞(embryonic stem cell)、神经嵴干细胞(neural crest stem cell)和毛囊干细胞(hair follicle stem cell)等，研究证实骨髓间充质干细胞、脂肪来源的间充质干细胞也能形成牙髓样组织[41]。

然而目前组织工程技术还只是处在研究发展阶段，虽有众多的生物材料可供选择，但均未有牙髓牙本质复合体再生，距功能性牙髓再生还有很长的路要走。

血运重建在一定程度上解决了当下临床问题，延长患牙的使用寿命，然而仍缺少大规模的临床研究数据，并且组织学牙髓再生没有真正实现，组织工程的引入为牙髓再生治疗提供新的思路，目前研究较多的有3D打印、细胞膜片等技术，但干细胞的来源、储存问题，适宜支架材料的选择，生物工程微环境的构建等一系列问题给我们带来了很大的挑战，因此需要多学科共同协同发展，以期创建干细胞牙髓样分化的微环境，实现牙功能性牙髓的再生，为患者带来真正的福音。

[1] Chaniotis A.Treatment Options for Failing Regenerative Endodontic Procedures: Report of 3 Cases[J].Journal of Endodontics，2017，43(9):1472.

[2] Park H B，Lee B N，Hwang Y C，et al.Treatment of non-vital immature teeth with amoxicillin-containing triple antibiotic paste resulting in apexification[J].Restorative Dentistry & Endodontics，2015，40(4):322.

[3] Lin L M，Ricucci D，Huang G T.Regeneration of the dentine-pulp complex with revitalization/revascularization therapy: challenges and hopes[J].International Endodontic Journal，2014，47(8):713.

[4] OSTBY BN.The Role of the Blood Clot in Endodontic Therapy an Experimental Histologic Study[J].Acta Odontologica Scandinavica，1961，19(3-4):324.

[5] Alobaid A S，Cortes L M，Lo J，et al.Radiographic and Clinical Outcomes of the Treatment of Immature Permanent Teeth by Revascularization or Apexification: A Pilot Retrospective Cohort Study[J].Journal of Endodontics，2014，40(8):1063.

[6] Nosrat A，Seifi A，Asgary S.Regenerative endodontic treatment (revascularization) for necrotic immature permanent molars: a review and report of two cases with a new biomaterial[J]. Journal of Endodontics，2011，37(4):562.

[7] Asgary S，Fazlyab M，Nosrat A.Regenerative Endodontic Treatment versus Apical Plug in Immature Teeth: Three-Year Follow-Up[J].Journal of Clinical Pediatric Dentistry，2016，40(5):356.

[8] Wigler R，Kaufman A Y，Lin S，et al.Revascularization: a treatment for permanent teeth with necrotic pulp and incomplete root development[J].J Endod，2013，39(3):319.

[9] Aktener B O，Bilkay U.Smear layer removal with different concentrations of EDTA-ethylenediamine mixtures[J].Journal of Endodontics，1993，19(5):228.

[10] Galler K M，Buchalla W，Hiller K A，et al.Influence of Root Canal Disinfectants on Growth Factor Release from Dentin[J].Journal of Endodontics，2015，41(3):363.

[11] Conde M C，Chisini L A，Demarco F F，et al.Stem cell-based pulp tissue engineering: variables enrolled in translation from the bench to the bedside，a systematic review of literature[J]. International Endodontic Journal，2016，49(6):543.

[12] Galler K M，Widbiller M，Buchalla W，et al.EDTA conditioning of dentine promotes adhesion，migration and differentiation of dental pulp stem cells[J].International Endodontic Journal，2016，49(6):581.

[13] Sabrah A H，Yassen G H，Liu W C，et al.The effect of diluted triple and double antibiotic pastes on dental pulp stem cells and established Enterococcus faecalis biofilm[J].Clinical Oral Investigations，2015,19(8):2059.

[14] Diogenes A，Henry M A，Teixeira F B，et al.An update on clinical regenerative endodontics[J].British Dental Journal，2013，215(6):2.

[15] Guo Y J，Du T F，Li H B，et al.Physical properties and hydration behavior of a fast-setting bioceramic endodontic material[J].Bmc Oral Health，2016，16(1):1.

[16] Harlamb S C.Management of incompletely developed teeth requiring root canal treatment[J].Australian Dental Journal，2016，61 Suppl 1(S1):95.

[17] Alobaid AS，Cortes LM，Lo J，et al.Radiographic and Clinical Outcomes of the Treatment of Immature Permanent Teeth by Revascularization or Apexification: A Pilot Retrospective Cohort Study[J].Journal of Endodontics，2014，40(8):1063.

[18] Yang J，Yuan G，Zhi C.Pulp Regeneration: Current Approaches and Future Challenges[J].Frontiers in Physiology，2016，7(99):58.

[19] Simon S，Ajberdal S.The MAP Kinase Pathway Is Involved in Odontoblast Stimulation via p38 Phosphorylation[J].Journal of Endodontics，2010，36(2):256.

[20] Andreasen J O，Borum M K，Andreasen F M.Replantation of 400 avulsed permanent incisors.3.Factors related to root growth[J].Endodontics & Dental Traumatology，1995，11(2):69.

[21] Kling M，Cvek M，Mejàre I.Rate and predictability of pulp revascularization in therapeutically reimplanted permanent incisors[J].Dental Traumatology，1986，2(3):83.

[22] Laureys W G，Cuvelier C A，Dermaut L R，et al.The critical apical diameter to obtain regeneration of the pulp tissue after tooth transplantation，replantation，or regenerative endodontic treatment[J].Journal of Endodontics，2013，39(6):759.

[23] Yang J W，Zhang Y F，Sun Z Y，et al.Dental pulp tissue engineering with bFGF-incorporated silk fibroin scaffolds[J].Journal of Biomaterials Applications，2015，30(2):221.

[24] Jiang X，Liu H，Peng C.Clinical and Radiographic Assessment of the Efficacy of a Collagen Membrane in Regenerative Endodontics: A Randomized，Controlled Clinical Trial[J].Journal of Endodontics，2017，43(9):1465.

[25] Lovelace T W，Henry M A，Hargreaves K M，et al.Evaluation of the delivery of mesenchymal stem cells into the root canal space of necrotic immature teeth after clinical regenerative endodontic procedure[J].Journal of Endodontics，2011，37(2):133.

[26] Hargreaves K M，Diogenes A，Teixeira F B.Treatment Options: Biological Basis of Regenerative Endodontic Procedures[J]. Journal of Endodontics，2013，39(3):30.

[27] Saoud T M A，Ashraf Z，Ahmed N，et al.Histological observations of pulpal replacement tissue in immature dog teeth after revascularization of infected pulps[J].Dental Traumatology Official Publication of International Association for Dental Traumatology，2015，31(3):243.

[28] Martínez C E，Smith P C，Alvarado V A P.The influence of platelet-derived products on angiogenesis and tissue repair: a concise update[J].Frontiers in Physiology，2015，6:290.

[29] Smith A J，Scheven B A，Takahashi Y，et al.Dentine as a bioactive extracellular matrix[J].Archives of Oral Biology，2012，57(2):109.

[30] Kim S G，Zhou J，Solomon C，et al.Effects of growth factors on dental stem/progenitor cells[J].Dental Clinics of North America，2012，56(3):563.

[31] Wen Z，Zhang X，Ling J，et al.Osteo-/odontogenic differentiation of BMP2 and VEGF gene-co-transfected human stem cells from apical papilla[J].Molecular Medicine Reports，2016，13(5):3747.

[32] Galler K M，D′Souza R N，Federlin M，et al.Dentin Conditioning Codetermines Cell Fate in Regenerative Endodontics[J]. Journal of Endodontics，2011，37(11):1536.

[33] Torabinejad M，Milan M，Shabahang S，et al.Histologic Examination of Teeth with Necrotic Pulps and Periapical Lesions Treated with 2 Scaffolds: AnAnimal Investigation[J].Journal of Endodontics，2015，41(6):846.

[34] Bezgin T，Yilmaz A D，Celik B N.Concentrated platelet-rich plasma used in root canal revascularization: 2 case reports[J]. International Endodontic Journal，2014，47(1):41.

[35] Bezgin T，Yilmaz A D，Celik B N，et al. Efficacy of platelet-rich plasma as a scaffold in regenerative endodontic treatment[J].Journal of Endodontics，2014，41(1):36.

[36] Bezgin T，Yilmaz A D，Celik B N.Concentrated platelet-rich plasma used in root canal revascularization: 2 case reports[J]. International Endodontic Journal，2014，47(1):41.

[37] Mittal N，Narang I.Revascularization of Immature Necrotic Teeth: Platelet rich Fibrin an Edge over Platelet rich Plasma[J]. Dental Hypotheses，2012，3(1):29.

[38] Narang I，Mittal N，Mishra N.A comparative evaluation of the blood clot，platelet-rich plasma，and platelet-rich fibrin in regeneration of necrotic immature permanent teeth: A clinical study[J].Contemporary Clinical Dentistry，2014，6(1):63.

[39] Gronthos S，Brahim J，Li W，et al.Stem cell properties of human dental pulp stem cells[J].Journal of Dental Research，2002，81(8):531.

[40] Sonoyama W，Liu Y，Fang D，et al.Mesenchymal stem cell-mediated functional tooth regeneration in swine[J].Plos One，2006，1(1):e79.

[41] Huang G T J，Alhabib M，Gauthier P.Challenges of stem cell-based pulp and dentin regeneration: a clinical perspective[J].Endodontic Topics，2013，28(1):51.