HPV16 E6-G350基因表达促进宫颈癌C33A细胞增殖且抑制凋亡

潘贞贞 ，宋宇宁 ，者湘漪 ，吴文礼 ，许静 ，徐航 ，辛皖潮 ，张斌 ，辛慧珍，曹冬冬，潘泽民*

（1新疆兵团第四师医院，新疆 伊犁 835000；2新疆地方与民族高发病教育部重点实验室/石河子大学医学院生物化学教研室，新疆 石河子 832002；3新疆伊犁哈萨克自治州友谊医院，新疆 伊犁 835000）

子宫颈癌是全球女性常见恶性肿瘤，也是导致癌症死亡的主要原因，据统计在2012年全球有527624例新发病例和265653例死亡病例[1]。宫颈癌的发生和发展与诸多因素相关，德国科学家最先发现人乳头瘤病毒（HPV）可导致宫颈癌发生。在已经被检测出的HPV型别中有20余种被划分为高危型HPV，其中HPV16与宫颈癌的发生关系最密切，可引起约70%的宫颈癌。HPV16基因组的E6和E7为最重要的细胞周期调节因子[2]，在组织培养系统中，E6和E7的表达可以导致人类角化细胞的永生化[3]。HPV16致癌主要与癌基因E6和E7的活性相关，这些癌基因能与部分细胞蛋白相结合，从而干扰正常细胞的凋亡、分化、粘附、细胞周期和免疫应答，促进宫颈发生癌变[4-5]。有研究表明，E6基因多个位点突变影响HPV16病毒的抗原性，免疫原性以及易感性[6-7]。T350G是欧洲株中最常见的多态性突变，它引起亮氨酸到缬氨酸（L83V）的改变。本课题组前期分析43例新疆维吾尔族宫颈癌 HPV16病毒 E6和E7基因序列，发现E6基因有34例E6基因350位核苷酸发生突变（T350G），突变频率为79.1%[8]。为了进一步分析这种突变，本研究通过真核转染实验研究此突变位点在宫颈癌发展中的作用，有助于人们充分认识HPV，为HPV导致宫颈癌的诊断和治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 细胞与质粒来源

宫颈癌C33A细胞株由本实验室保存提供，HPV16 E6原型质粒购于美国Addgene公司。

1.2 质粒的构建

HPV16 E6原型和突变型均由上海吉凯基因公司设计合成，质粒名称为GV230，详细信息（表1）。

表1 HPV16 E6引物信息Tab.1 HPV16 E6 primer information

1.3 细胞的培养

C33A细胞采用10%FBS DMEM含青霉素-链霉素双抗细胞培养基，37℃，5%CO2培养箱常规培养。

1.4 C33A细胞的稳定转染

C33A细胞接种到6孔板中并分别转染HPV16 E6原型、HPV16 E6突变型和阴性对照质粒，使用FuGENE HD转染试剂（FuGENE HD瑞士罗氏公司），根据试剂说明书进行操作，转染48 h后筛选细胞，将细胞培养液换成含有G418（浓度为500 g/mL）的10%FBS DMEM细胞培养基，每3 d换液一次，14 d后形成稳定表达的单克隆细胞株。

1.5 间接免疫荧光实验

分别将C33A稳转细胞接种到放有盖玻片的六孔板中，每孔接种密度为 1.0×105／mL，37℃，5%CO2培养箱中培养12 h；4%多聚甲醛，在4℃冰箱中固定 30 min；0.25% TritonX-100透化 2-5 min；加入1 mL10%山羊血清室温下封闭30 min；加一抗（SANTA公司 HPV16 E6抗体，5%山羊血清 1∶50稀释），37 ℃，湿盒中孵育 2 h；将 150 μL荧光二抗 (北京中杉金桥公司罗丹明标记抗体，5%山羊血清1∶100稀释)加在玻片上，放入湿盒中，37℃，避光孵育2 h。在荧光显微镜下观察，拍照记录。

1.6 CCK8细胞增殖实验

将筛选好的稳定转染细胞接种于96孔板，每孔加入 100 μL 10%FBS DMEM培养基，每孔接种3000个细胞，每个组设置4个复孔。5%CO2、37℃培养箱过夜至第二天待细胞贴壁设为0 h点，CCK8试剂（日本同仁公司）平衡至室温，分别到 0、24、48、72 h 4个检测时间点每孔加入CCK8试剂10 μL，轻轻敲打孔板使试剂与培养液充分混匀，并置于5%CO2、37℃培养箱中孵育3 h，到时间后将其用锡箔纸避光包好，酶标仪（ELx808，Bio-Rad公司，美国）上测定选择450 nm处吸光度值(optical density，OD)。

1.7 细胞平板克隆实验

分别将C33A稳转细胞接种到六孔板中，每孔接种1000个细胞，继续培养14 d后用4%多聚甲醛2 mL固定细胞，加入0.4%结晶紫染色，显微镜下计数克隆大于50个细胞的克隆数。

1.8 细胞凋亡实验

细胞凋亡实验使用凋亡试剂盒（联科生物，杭州）通过流式细胞仪（BD FACSAria III，BD公司，美国）进行检测，Annexin V-APC和 7-AAD染色 C33A细胞，根据说明书操作。

1.9 统计学分析

所有统计数据均采用SPSS17.0软件进行分析。计量资料用均数±标准差表示，服从正态分布且方差齐的多组比较采用方差分析，对不符合条件的使用多个独立样本的秩和检验，<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成功构建HPV16 E6原型（T295/T350）和HPV16 E6-G350突变（T295/G350）质粒，且测序正确

成功构建 HPV16E6原型 （T295/T350）和HPV16E6-350突变（T295/G350）质粒且测序正确如图1所示。

图1 HPV16 E6基因真核表达质粒测序图Fig.1 Sequencing map of eukaryotic expression vector of HPV16 E6 gene

2.2 HPV16 E6在宫颈癌C33A细胞中的表达

在宫颈癌C33A细胞中，分别转染GV230空质粒，HPV16E6原型 （T295/T350） 质粒和 HPV16 E6-G350突变（T295/G350）质粒，转染 48 h后利用显微镜观察间接免疫荧光法检测HPV16 E6的表达。如图所示使用HPV16 E6抗体检测各组HPV16 E6蛋白的表达，GV230空质粒组作为对照组没有红色荧光，表明C33A细胞无HPV16 E6蛋白表达；其他两个转染实验组均有红色荧光，显示HPV16 E6蛋白有表达，其中HPV16 E6原型组红色荧光较少，提示HPV16 E6蛋白表达量最少，HPV16 E6-G350突变组红色荧光最多，提示HPV16 E6蛋白表达量最多如图所示（图 2）。

实验结果提示，HPV16 E6-G350突变可增强HPV16 E6蛋白的表达。

图2 间接免疫荧光法检测C33A细胞HPV16 E6蛋白表达情况(200×）Fig.2 The expression of HPV16 E6 in C33A cells by indirect immunofluorescence(200×）

2.3 HPV16 E6突变对C33A细胞增殖的影响

在C33A 细胞中分别转染GV230空质粒，HPV16 E6原型（T295/T350）质粒HPV16 E6-G350突变（T295/G350）质粒，用 CCK8法检测各组在各时间点的OD值，判断C33A细胞的增殖。NC空质粒组作为对照组，HPV16E6原型质粒组和HPV16 E6-G350突变质粒组作为实验组。如图所示，在72 h时间点HPV16 E6原型组与NC组OD值有差异（ <0.05）；在 24 h和 48 h时间点 HPV16 E6-G350突变组与 NC组OD值均有差异（ <0.05），72 h时间点HPV16 E6-G350突变组与NC组OD值均有差异（ <0.01），实验重复 3遍，如图所示（图 3）。

实验结果提示，HPV16 E6表达的实验组细胞增殖能力高于对照组，HPV16 E6-G350突变增殖能力比HPV16 E6原型强。

图3 HPV16 E6突变对C33A细胞增殖的影响Fig.3 The effect of HPV16 E6 mutation on the proliferation of C33A cells

2.4 HPV16 E6突变对C33A细胞克隆形成的影响

将稳定转染 GV230空质粒、HPV16E6原型（T295/T350）质粒和 HPV16E6-G350突变（T295/G350）质粒的C33A细胞接种在6孔板中，密度为1000个细胞/孔，培养箱中培养14 d。

显微镜下计数具有50个细胞以上的细胞集落。实验重复3遍，如图所示（图4）。

该实验结果提示与CCK8增殖实验结果一致，两个实验组细胞克隆集落数明显多于NC对照组，HPV16 E6-G350突变C33A细胞克隆数最多。NC组与各HPV16 E6表达组相比存在差异且差异均具有统计学意义(<0.01)。

图4 HPV16 E6突变对C33A细胞克隆形成的影响Fig.4 Effect of HPV16 E6 mutation on the formation of C33A cell clones

2.5 HPV16 E6突变对C33A细胞凋亡的影响

利用流式细胞术进行细胞凋亡分析，检测各组细胞的凋亡率，凋亡率包括Q2和Q4象限总和值，在宫颈癌C33A细胞中，GV230空质粒NC组细胞凋亡率明显高于 HPV16 E6原型质粒组 (<0.05)和HPV16 E6-G350突变质粒组(<0.01)。HPV16 E6原型组与HPV16 E6-G350突变组凋亡率之间存在差异，但差异无统计学意义(＞0.05)，如图所示（图5）。

这一结果提示HPV16 E6抑制宫颈癌C33A细胞的凋亡，HPV16 E6-G350突变的抑制凋亡作用比HPV16 E6原型强。

图5 HPV16 E6突变对C33A细胞凋亡的影响Fig.5 The effect of HPV16 E6 mutation on the apoptosis of C33A cells

3 讨论

HPV是导致宫颈癌的主要因素之一，其中HPV16是高危型HPV中致癌性最强的基因型。流行病学研究证实，不同的HPV16变异株可表现出不同的致癌潜能和生物学活性，同时也具有一定的地域性，这种地域之间的差异与宿主的人类白细胞抗原（HLA）多态性相关[9-10]。HPV16谱系具有地理区域集中分布现象，以及民族间的差别。中国汉族女性中HPV16亚型的分布主要为欧洲株和亚洲株。在摩洛哥妇女HPV16 E6 T295/G350突变普遍存在于高度宫颈损伤中，并且与宫颈癌的进展关系密切。不同的HPV16亚型具有不同的致癌潜能，可能与某些重要序列位点突变有关[11-14]。一些实验研究表明HPV16 E6基因突变体的自然变异性足以改变由E6诱导的细胞功能活性，例如对血清/钙分化的抗性，原代人角质细胞寿命的延长和人永生化细胞中p53和Bax表达水平的减少，人角质细胞的凋亡、转化和永生化，但是，负责这些改变的以及基因参与其调节的机制尚未明确[15-16]。每一种突变都有特定的基因表达，这些基因大多参与粘附、增殖、凋亡、迁移和侵袭。

我们通过一系列细胞学实验来分析HPV16 E6致癌蛋白基因不同突变体的作用，选取HPV阴性的宫颈癌C33A细胞进行转染，比较HPV16E6 T295/T350欧洲原型和HPV16 E6 T295/G350欧洲突变型。选择此细胞模型是由于C33A为一个具有pRB和p53基因突变的宫颈癌细胞，它不具有高危型HPV癌蛋白E6的致癌作用[17]。我们的研究结果显示，HPV16 E6 T295/T350欧洲原型和HPV16 E6 T295/G350欧洲突变型两者均可促进宫颈癌细胞的增殖，抑制凋亡；HPV16 E6 T295/G350欧洲突变型的促癌作用更强。我们的结果可能可以部分解释这种突变的致癌潜能，为HPV导致宫颈癌的诊断和治疗提供新靶标。

4 结论

HPV16E6 T295/T350欧洲原型和HPV16 E6 T295/G350欧洲突变型均可以促进宫颈癌细胞的增殖，抑制凋亡，HPV16 E6 T295/G350欧洲突变型的促癌作用比HPV16 E6 T295/T350欧洲原型强。