超高效液相色谱法快速测定烟草样品中的植物色素

王晋 黄海涛 刘欣 许永 李晶 孔维松 张涛 张承明 杨光宇 李雪梅

摘要：建立超高效液相色谱法快速测定烟草中植物色素（新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素-a、叶绿素-b、β-胡萝卜素）检测方法。90%丙酮超声萃取30 min，色谱柱为Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），流动相为乙腈-水梯度洗脱，以体积比按（乙腈90%+10%水），4.0 min（100%乙腈）的梯度条件，流速为0.8 mL/min，用二极管阵列检测器检测。6种色素在5 min内分离，检测限15～22 ng/mL，平均回收率为93%～105%。采用自主设计的样品萃取瓶进行前处理，前处理简单快速，同时，色谱分离周期明显缩短，与目前行业标准相比，样品分析效率提高了4倍以上。

关键词：超高效液相色谱;烟草;植物色素;快速测定

中图分类号：O656.3         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）22-0124-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.22.034           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： Established a ultra performance liquid chromatography（UPLC） method for the rapid determination of plant pigments（neoxanthin，violaxanthin，lutein，chlorophyll-a，chlorophyll-b and β-carotene） in tobacco. The plant pigments were extracted from samples with 90% acetone by ultra-sonic extraction. Then，the plant pigments were separated by Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm） column， with and water mixture as mobile phase at a flow-rate of 0.8 mL/min. It eluted with gradient elution （90% V（acetonitrile））+10% V（water）） at the beginning，then the gradient elution replaced by acetonitrile 4 min later. These plant pigments were detected by diode array detector. Under the optimal conditions，6 kinds of plant pigments could be effectively separated within 5 min. The limits of detection（LODs） of 6 kinds of plant pigments were 15～22 ng/mL and the average recoveries were in the range of 93% to 105%. Via the self-designed sample extraction bottle using for pretreatment，and improved chromatography conditions，this method efficiency was enhanced 4 times than the current tobacco standard.

Key words： ultra performance liquid chromatography; tobacco; plant pigments; rapid determination

植物色素是煙草生长和利用太阳能进行光合作用的重要物质，同时也是影响烟草品质的重要成分，它们对烟叶的色泽和香味也有着重要影响[1-4]。在烟叶调制过程中，叶绿素类化合物的降解是评价烟叶调制好坏的重要指标，类胡萝卜素是烟草中重要的香气前体化合物，许多烟草特征香气成分，如β-大马酮、巨豆三烯酮、二氢猕猴桃内酯等均是类胡萝卜素降解产物[1-5]。因此，烟草中植物色素的准确测定对烟草质量评价具有重要的意义。烟草色素的测定通常采用分光光度法、近红外光谱法和高效液相色谱法，其中分光光度法准确性较差，而近红外光谱法只能进行1种半定量的预测[4-7]。传统的液相色谱法由于分离效率高、选择性好、检测灵敏度高、操作自动化，在烟草植物色素分析中得到了广泛应用[6，7]。目前烟草行业标准YC/T 382-2010就采用高效液相色谱法测定烟草中的质体色素。

现有标准方法前处理和色谱分析时间长，对大量样品进行快速化学分析评价，这些方法很难满足需求。超高效液相色谱是2004年Waters公司推出了的新技术，该技术突破了传统色谱分析的局限性，极大地提升了高效液相色谱的分析速度，近几年来在国内得到了广泛应用[6-8]。为了得到更简便、快速的分析方法，对超高效液相色谱法测定烟草中植物色素进行了研究，每个样品的色谱分析时间可缩短到5 min[5-7]。研究还通过自主设计的样品萃取瓶，大大简化了样品前处理操作，使样品前处理周期也大大缩短。改进方法和目前行业标准相比，日样品分析量可提高4倍以上。该方法的建立为烟草样品中的植物色素的检测提供了快速、准确、可靠的高通量分析方法。

1  材料与方法

1.1  主要仪器与试剂

Waters ACQUITY UPLC超高效液相色谱系统，包括四元泵、自动进样器、二极管阵列检测器和Empower色谱工作站。

水为石英亚沸蒸馏水，并用Milli-Q50超纯水仪处理，电阻≥18 m？赘;乙腈和丙酮均为色谱纯进口试剂（Fisher公司生产）;叶绿素-a、叶绿素-b、叶黄素、？茁-胡萝卜素、新叶黄素和脱镁叶绿素标准（Sigma公司和Fluka公司生产，含量>97%）。

改进的样品萃取瓶见图1，样品萃取瓶由带密封圈的外套管（图1a）和带0.45 μm过滤筛板的内套管（图1b）组成。

1.2  色谱条件

色谱柱为Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18 （2.1 mm×50 mm，1.7 μm）;流动相为乙腈-水梯度洗脱，以体积比按0 min（乙腈90%+10%水），4.0 min （100%乙腈）的梯度条件，流速为 0.8 mL/min，进样体积5.0 μL，柱温30 ℃。叶黄素检测波长为444.9 nm，β-胡萝卜素检测波长为452.1 nm，叶绿素-a检测波长为649.5 nm，叶绿素-b检测波长为664.2 nm，紫黄质检测波长为441.2 nm，新叶黄素（新黄质）检测波长为442.4 nm，脱镁叶绿素测波长为445.4 nm。

1.3  样品处理

烟草样品按YC/T 382-2010的方法制备，将样品萃取瓶外套管（图1a）置于不锈钢试管架上，准确称取样品（新鲜烟叶0.2 g或烤烟1.0 g），加入外套管中，用25 mL的移液枪，往装有样品的套管中加入25 mL的90%丙酮，然后将萃取瓶的内套管卡在外套管的口部（图1c）。装好后将带样品瓶的试管架用恒温超声波水浴锅超声萃取35 min。萃取完后把萃取瓶的内套管向下压，萃取溶液就通过过滤筛板进入到内套管中，并从内套管中的细弯管流出，到达样品过滤的效果（图1d）。从细弯管口收集萃取液，弃去最初的2～3 mL，然后用色谱进样瓶直接收集1.0～1.5 mL的样品萃取液，用于液相色谱分析。

2  结果与分析

2.1  样品前处理

对于烟草中植物色素的测定，主要采用的是烟草行业标准YC/T 382-2010，即采用90%丙酮超声萃取的方法进行检测。因此，本试验中参照行业标准，采用90%丙酮不同时间进行超声萃取，结果表明，超声萃取30 min，样品中的色素可萃取完全。收集萃取过的残渣再萃取一次，萃取液中已经没有色素检出。为了进一步减少样品前处理环节，本研究中设计了如图1所示的新样品萃取瓶，该样品萃取瓶由带密封圈的外套管（图1a）和带0.45 μm过滤筛板的内套管（图1b）组成。在样品萃取瓶外套管（图1a）中加入烟草样品，然后再加入萃取溶剂（90%丙酮）。为了防止样品萃取过程中萃取溶液溅出或超声水浴锅中的水溅入，将萃取瓶的内套管卡在外套管的口部（图1c）。装好后将样品瓶放到电热恒温超声波水浴锅中超声萃取。萃取完后将萃取瓶的内套管向下压，萃取溶液通过过滤筛板进入到内套管中，从内套管中的细弯管流出，用色谱进样瓶从细弯管口部收集流出的萃取溶液，直接可进行液相色谱分析。

整个样品前处理过程中不需要样品转移就能得到过滤好的待分析样品，前处理操作得到很大的简化。操作过程中样品前处理步骤的简化，减少了有可能引入误差的环节，分析结果的精密度也会相应的提高。另外，按常规方法样品前处理操作时，用针头过滤器过滤过程中，烟草细粉会堵塞过滤头，过滤速度较慢;而在改进的处理方法中，超声萃取完成后稍静置，烟草样品粉末就沉到底部，过滤时内套管中的筛板只与上层清夜接触，这样可有效地避免过滤过程中的筛板堵塞，过滤速度更快，操作更容易实现。

2.2  色譜条件的选择

植物色素通常采用甲醇-异丙醇、水-乙腈、水-四氢呋喃等体系。采用甲醇作为流动相时，？茁-胡萝卜素峰型较差，此外，水-四氢呋喃和甲醇-异丙醇体系存在系统反压高且毒性大的问题[6-10]。由于使用水-乙腈体系系统反压小，所有待测成分均能达到基线分离，因此试验选用水-乙腈体系。通过不同比例的水和乙腈作流动相 （包括梯度条件）等试验条件的选择，结果表明，按0 min（乙腈90%+10%水），4.0 min（100%乙腈），保持1.0 min，0.5 min回到起始梯度，平衡2.0 min后，继续进下一个样品的梯度条件，烟草样品中的色素能达到完全分离且分离时间短，因此试验选用该条件。为了获得最佳灵敏度，采用二极管阵列检测器，各待测成分均在其最大吸收波长下进行检测，其检测波长分别为叶黄素检测波长444.9 nm，β-胡萝卜素检测波长452.1 nm，叶绿素-a检测波长649.5 nm，叶绿素-b检测波长664.2 nm， 紫黄质检测波长441.2 nm，新黄质检测波长442.4 nm。

在选定试验条件下，标样和实际样品的色谱图如图2所示。由图2可知，各待测组分均达到了基线分离，且色谱峰对称性好，无明显拖尾。另外，与目前的烟草行业标准相比，每个样品色谱分离时间缩短了5倍。

2.3  工作曲线

分别配制浓度为50、10、2.0、0.4、0.08 μg/mL的标准溶液，进样后计算出不同浓度下的峰面积，计算出回归方程，结果如表1所示。根据信噪比为S/N=3，测得各组分最低检测浓度，其结果见表1。

2.4  回收率试验及精密度

回收率试验，称取相同样品2份，其中一份为对照，另一份加入已知量的色素，通过加标样品测出量减去未加标样品测出量再除以标准加入量计算回收率，结果如表2所示。精密度试验，准确取烟草样品7份，在选定的色谱条件下平行测定7次，另取相同的烟草样品7份，在不同天内测定，计算7次测定结果的相对标准偏差（RSD），结果见表2所示。

2.5  樣品分析结果

按选定的样品前处理条件和色谱条件测定了烟草样品中的色素含量，结果见表3。

3  结论

针对目前烟草行业标准分析周期长，较难满足快速分析的需求。对快速液相色谱技术在烟草植物色素分析中的应用进行了研究。结果表明，烟草中的6种主要色素类化合物在5 min可完全得到分离。在0.5 min内回到起始梯度，保持2.0 min可达到平衡，继续进下一个样时保留时间无明显波动，整个样品色谱分离周期可缩短到7.5 min，与行业标准相比，效率提高5倍。研究还通过自主设计的样品萃取瓶，大大简化了样品前处理操作，使样品前处理周期也大大缩短。改进方法和目前行业标准相比，日样品分析量可提高4倍以上。方法的精密度、回收率均可满足烟草样品分析的需求，通过实际样品分析结果和行业标准方法进行对比，6种色素的分析结果均与烟草行业标准的测定结果相一致。该方法的建立为烟草中植物色素的分析提供了快速、准确、可靠的高通量分析方法。

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