不同reelin基因型小鼠大脑皮层分布的差异❋

李小英 郭 潇 周 洁 钱瑶瑶 张必超 杨慈清,2△

(1 新乡医学院生命科学技术学院, 2 河南省医用组织再生重点实验室, 新乡 453003)

在哺乳动物大脑皮层发育过程中,胶质细胞的突起向外延伸构成支架结构,众多的原始神经细胞沿此支架做变形运动由内向外迁移到正常的位置,同时完成分裂到分化的过程,在此过程中reelin蛋白在大脑皮层结构正常形成过程中起到关键作用[1]。Reelin几乎存在于所有的脊椎动物,人类reelin基因位于染色体7q22,其表达产物为3641个氨基酸残基,组成了一个巨大的分子量约为388kD的糖蛋白[2]。Reelin表达缺失的小鼠称为reeler鼠,研究表明,和reelin蛋白有关的任一自然突变或定向突变都会影响小鼠大脑皮层分层结构的形成,有研究表明,3种不同reelin基因型小鼠其神经解剖学结构彼此之间在脑的多个部位存在差别[3]。在reelin信号转导途径上,reelin及其蛋白受体包括极低密度脂蛋白受体(very low density lipoprotein receptor, VLDLR)和载脂蛋白E受体2(apolipoprotein E receptor 2, ApoeR-2)以及信号转导下游的蛋白磷酸化(disabled-1, Dab1)过程中有任一者发生突变都将导致胚胎脑的发育异常[4]。小鼠常在出生后20～30d内死亡。也有研究表明,人类的各种神经系统疾病与reelin的突变及异常表达有关,如自闭症患者reelin 基因5′端出现异常的GGC重复序列[5-6]。Reelin在精神分裂症患者皮层中间神经元中表达降低[7]。本研究拟通过特异性抗体对神经细胞的标记,对3种不同reelin基因型小鼠大脑皮层结构存在的差异进行比较分析,为reelin在小鼠大脑皮层各层结构形成过程中的作用研究提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

Reelin杂合子小鼠(西北农林科技大学赵善廷实验室赠);4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′, 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI, Roche);兔抗Foxp1一抗、兔抗Tbr-1一抗、兔抗NeuN一抗、鼠抗GFAP一抗(Abcam公司);Cy3标记山羊抗兔二抗、FITC标记山羊抗鼠(北京中杉金桥生物技术有限公司)Nikon ECLIPSE 80i荧光显微镜(日本Nikon);CM1850冰冻切片机(德国Leica)。

1.2 材料收集

取出生后10d经PCR鉴定后确定基因型小鼠,4.3% 的水合氯醛麻醉后,用4%的多聚甲醛经心灌注,剥离小鼠的全脑,将其放到4%多聚甲醛中,置保温盒4℃ 在摇床上摇晃过夜,第2天取出组织吸干多余的液体,将组织放到18%的蔗糖溶液中,在保温盒中摇床上摇晃过夜。等到脑组织沉淀到管底部时取出组织,吸干组织上的多余液体。经OCT包埋,液氮冷冻后置-80℃ 保存备用。切片时取出包埋组织,在冰冻切片机上冠状连续切片,切片厚度设置为20μm,每次10～20张载玻片,根据组织大小每张片子上循环贴5～10列,2～3行,保持37℃烤片机烤片30min,最后保存在-80℃中保存备用。

1.3 荧光免疫组织化学

-80℃冰箱中取出切片,37℃烤片机上进行烤片10min。1000ml烧杯中放入浓度为0.01mol/L,酸碱度为pH=6.0的柠檬酸盐缓冲液,将烧杯放到微波炉中加热沸腾;将切片置于切片架上,将其放入已经沸腾的缓冲液中,然后微波低火处理30min;取出烧杯,取出组织切片,然后将组织切片放在免疫组织化学湿盒中,用蒸馏水冲洗2次,之后用TBS(Tris-buffered saline, TBS)洗3次,每次5min。用含0.1% Triton X-100的1×TBS孵育5min,最后倒掉组织切片上的溶液,并用吸水纸将残留的溶液擦干,分别滴加合适浓度的第一抗体兔抗Foxp1、Tbr-1和兔抗NeuN(按照1∶500 的浓度用一抗稀释液稀释,稀释液配方： 2%的山羊血清+4%牛血清白蛋白+0.3% Triton X-100+0.1%的叠氮钠溶解于PBS中),一张切片300μl,4℃ 孵育过夜。次日,用1×TBS液体洗3次,每次5min,倒掉组织切片上的溶液后,避光滴加针对一抗的合适浓度Cy3标记的羊抗兔二抗(按照1∶500的浓度用二抗稀释液稀释,稀释液配方： 2%的山羊血清+4%牛血清白蛋白+0.1%的叠氮钠溶解于PBS中),4℃孵育6h。再用1×TBS液体洗3次,每次5min。避光条件下每张组织切片上加入300μl DAPI染色剂,染色10min,TBS洗3次,每次5min,封片剂封片后荧光显微镜进行观察拍照,进行GFAP(1∶500)双标的过程与以上方法相同,滴加二抗为FITC标记山羊抗鼠二抗。

1.4 图像处理分析

用Photoshop CS3软件处理图片,可将两种染色同位叠加在一起。

2 结果

2.1 不同reelin基因型小鼠大脑皮层结构的差异(图1，见封底)

对3种基因型小鼠大脑皮层DAPI染色结果显示(图1A、G、M),野生型小鼠(reelin+/+;1A)和杂合基因型小鼠(reelin+/-;1G)的大脑皮层DAPI标记的细胞核分布具有典型层的结构,但是各层细胞核密度高低存在差异,而reeler型小鼠(reelin-/-;1M)大脑皮层不具有典型的层的结构,细胞核呈弥散的分布。

2.2 FoxP1、NeuN、Tbr-1和GFAP在不同reelin基因型小鼠大脑皮层表达与分布的差异

FoxP-1因子(Forhead box p1)即叉头框因子P1特异性的标记新皮质第Ⅴ～Ⅵ层神经元,与FoxP-2相似,与语言能力的发展有关。Tbr-1是T-box基因家族成员之一,是一种哺乳动物脑特异性的标记物;NeuN是一种标记成熟神经元的核内蛋白标记物,在小鼠胚胎发育的17d开始,大脑皮层就有NeuN阳性表达的细胞[8];GFAP被广泛认为是成熟星形胶质细胞的标记物,在小鼠胚胎发育的14d开始,在大脑皮质就开始有GFAP阳性标记的细胞[9]。以上标记物都被广泛用于神经系统结构和功能性研究。因此,在本实验中用以上标记物对不同reelin基因型小鼠大脑皮层进行了标记。

在FoxP-1荧光免疫组织化学的结果显示,野生型(reelin+/+,图1B)和杂合型(reelin+/-,图1H)两种基因型小鼠的FoxP-1均在皮层的浅层表达,主要分布在皮层板(cortical plate, CP)-室管膜区(ventricular zone, VZ)区,在边缘带(marginal zone, MZ)区不存在其表达,特别是在reelin+/-小鼠大脑皮层中,室管膜下区(subventricular zone, SVZ)区的表达比reelin+/+型的更高,但是在reelin基因敲除(reelin-/-,图1N)小鼠大脑皮层中,FoxP-1的表达均匀分布在各区,特别在MZ区,野生型和杂合型小鼠大脑皮层中不表达的区域也有大量标记的细胞。进一步用NeuN标记成熟神经元,可以看到野生型(reelin+/+,图1C)和杂合型(reelin+/-,图1I)两种基因型小鼠的NeuN阳性细胞主要分布在CP和SVZ区。而reelin基因敲除小鼠(reelin-/-)在CP和SVZ区没有NeuN标记的神经元,而少数标记细胞只见于MZ区(图1O)。Tbr-1标记的细胞中,可以看到,在野生型(图1D)和杂合子(图1J)中,Tbr-1标记细胞主要分布在CP-SVZ区,而在杂合子(图1J)中SVZ区标记的细胞更多,但是在reelin基因敲除小鼠(reelin-/-)中Tbr-1标记的细胞只在MZ区(图1P),其他区没有被标记的细胞。进一步用GFAP标记了胶质细胞,结果显示(图1E、K、Q),在野生型(图1E)和杂合子(图1K)中,GFAP标记的胶质细胞在VZ区有规律的分布,但是在reelin基因敲除小鼠(图1Q)中GFAP标记的细胞杂乱分布在各区,没有规律可循,将Tbr-1和GFAP标记结果叠加(图1F、L、R)后可以更清楚看到3种不同基因型小鼠大脑皮层各自被标记细胞的差异。

3 讨论

大量研究已经表明一系列神经精神疾病如阿尔茨海默病[10]、精神分裂症[11]、孤独症[12]、癫痫[13]等均与reelin蛋白表达的异常有关,这些疾病产生的具体机制以及与reelin之间的关系尚不明确,这也提示reelin可能具有更为复杂的功能,因此,未来reelin可能作为神经系统这些疾病的诊断、治疗靶点。

本研究对不同reelin基因型小鼠的大脑皮层的结构进行了比较,实验结果显示,在小鼠大脑皮层形成过程中reelin的表达对其结构的形成具有重要影响。在reelin基因敲除重合子中,其皮层的结构模糊,不具有典型的层的结构,大量文献表明reeler小鼠大脑皮层结构发生了反转[14-15],本研究中同样观察到reelin基因敲除重合子中皮层异常,与报道的结果一致。关于reelin在大脑皮层形成过程中的作用也是神经系统发育过程中研究的热点[16]。许多研究表明reelin在神经元迁移中具有双重角色,具有吸引和阻止神经元迁移的双重作用[17]。在本实验中也对reelin杂合子小鼠大脑皮层形态结构进行了染色和标记。通过对比显示,在杂合子中,皮层具有层的结构,但是与野生型相比,Fox-P1、NeuN和Tbr-1标记的细胞所在部位并不是完全相同,该结果与Badea等[3]的结果保持一致。因此,也说明在杂合子中由于reelin的异常表达对其产生相应的影响。由于reelin敲除重合子小鼠存活能力极差,如果饲养不周,在出生后20～30d就会死亡,因此,本实验在出生后10d进行基因型鉴定并完成实验。Reeler鼠不但生活能力差并伴有许多组织器官发育的缺陷,很难作为疾病动物模型,而reelin杂合型小鼠生存能力较强,并表现出一些列神经精神系统疾病的特征,所以被广受关注。因此,对reelin功能的研究不但只是在神经系统中单纯的调控功能,更重要的是其在神经系统疾病中的功能研究,本研究通过对3种不同reelin基因型小鼠大脑皮层结构的比较,充分说明了reelin在大脑皮层形成过程中对层形成存在影响,也为不同reelin基因型小鼠作为疾病模型的研究提供了依据。