补肾活血方调节淋巴回流对小鼠骨关节炎的影响❋

石继祥，商培洋，周 旭，周 强，章筛林，庞金辉，周军杰，虞陆超， 卫彦强，郝胜坤，王文燕，庄伟康，朱鹏飞

(上海中医药大学附属普陀医院， 上海市普陀区中心医院骨科,上海 200062)

淋巴系统作为免疫系统重要组成部分，其主要功能是将组织液转输到血管而重入血循环，这对人体维持内稳态至关重要[1]。淋巴回流功能一旦发生障碍，其结果必然是组织液过剩而出现机体水肿，随之而来的是代谢产物、炎性因子等局部蓄积，从而导致包括膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)在内的多种疾病的发生与发展[2]。本课题组前期研究已发现，KOA多有关节肿胀、疼痛，且病程中伴随着明显的淋巴管结构及功能变化，表明淋巴管功能障碍可能是KOA的重要机制之一[3]。KOA属于中医学“痹症”“骨痹”等范畴，其病机为肝肾亏虚，外邪乘虚袭于经络，属本虚标实之证，临床治疗常以补肾活血为主。根据传统中医理论，同时结合我院伤科经验，自拟补肾活血方随证加减，可有效缓解KOA关节肿胀、疼痛等症状，促进膝关节功能恢复且疗效确切[4-5]。本研究拟观察补肾活血方对KOA小鼠淋巴管功能的调节作用，为进一步深入探讨其作用机制提供依据。

1 材料

1.1 实验药物

补肾活血方组成：怀牛膝12 g，骨碎补12 g，补骨脂10 g，水蛭5 g，鸡血藤30 g，黄芪24 g，川芎12 g，当归24 g，熟地黄24 g，甘草9 g等，由上海中医药大学附属普陀医院/普陀区中心医院药剂科提供。将小鼠(20 g)与人(60 kg)的常规中药用量按《实验动物药理学》进行换算(换算系数9.01)，则小鼠所服补肾活血方(166 g)煎剂浓度为1.75 g/ml；取上述中药5剂加5倍水(4150 ml)浸泡30 min，煮沸后继续煎煮30 min，以消毒纱布过滤得首煎液；所余药渣再加5倍水(4150 ml)，重复以上步骤得次煎液；将2次煎液混合后加热浓缩至477 ml，得补肾活血方浓缩煎剂，-80℃冰箱保存以备用。

1.2 主要试剂与仪器

高精确电子天平(Biotech德国)；TP1020型组织脱水机、RM2135型轮转式切片机、HI1220型烘片机、OLYMPUS BX50荧光显微镜、TCS SP5Ⅱ激光共聚焦显微镜(LEICA德国)；BX-50型生物倒置显微镜(Olympus日本)；JEM-1200EX 透射电镜图像数字分析仪(Bio-Rad美国)；小动物麻醉机(Matrx VMR 美国)；近红外成像系统(Fluoptics-Hubtech21 Inc.美国)；吲哚菁绿(ICG，Acorn美国)；异氟烷(深圳沃瑞德科技有限公司NO.217140901)等。

1.3 实验动物

SPF级10周龄雄性C57BL/6 小鼠30只，体质量(23 ±2)g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供(动物许可证号SCXK(沪)2017-0005)。SPF级动物房中饲养，室温15～25℃，湿度 45%～60%，标准饲料喂养，常规饮水。适应性饲养2周后，小鼠随机分成假手术组、模型组和补肾活血方组3组各10只。所有实验获得上海中医药大学附属普陀医院医学实验动物伦理委员会批准。

2 方法

2.1 动物分组及造模

模型组(meniscal-ligamentous injury induced osteoarthritis，MLI-OA，半月板副韧带损伤OA模型)及补肾活血方组小鼠均采用右膝关节内侧皮肤切口，以膝关节为中心，长约5 mm，暴露并切断内侧副韧带后打开膝关节，找到内侧半月板前部并分离其与胫骨的附着点，然后切除内侧半月板前部，缝合皮肤关闭切口；假手术组小鼠皮肤切口相同，但只切开关节囊而不切断其他结构[3,6]。

2.2 药物干预

造模结束后，术后第2天补肾活血方组小鼠即开始灌胃给药，每次灌胃量为0.2 ml/只；假手术组和模型组小鼠则给予同等剂量0.9%氯化钠溶液灌胃，每天1次，4周为1个疗程，持续12周。

2.3 膝关节肿胀度测量

在造模当天及术后4、8、12周分别测量小鼠肿胀程度。用游标卡尺测量每组小鼠右膝关节横向直径(mm)，计算膝关节肿胀度(%)[7]，公式为：膝关节肿胀度(%)=(右膝关节直径-左膝关节直径)/左膝关节直径×100。

2.4 淋巴管回流功能检测

每4周使用近红外线-吲哚菁绿成像系统(indocyanine green-near infrared，NIR-ICG) 检测淋巴管回流变化情况，将小鼠使用异氟烷麻醉后双下肢脱毛，以30号针头注射10 μL的ICG(浓度为0.1μg/ml，蒸馏水溶解，避光保存)染料于小鼠髌韧带中间注入关节腔内，在NIR照射下观察荧光信号，淋巴管的信号强度趋于稳定后观测24 h (期间每隔1 s拍照1次，图片保存以备分析)，记录信号渐由膝关节经集合淋巴管进入腹股沟淋巴结过程。使用Image J软件可计算膝关节ICG的信号强度(signal，S)及达峰时间(Tmax)变化情况；并计算膝关节周围淋巴管的ICG清除率[3,8-9]，如ICG注射后6 h的清除率(Clearance)=(S6h-S1h)/ S1h×100%。

2.5 组织病理学检测及评分

于术后4、12周处死小鼠，每组5只，剔除周围皮肤及肌肉，完整膝关节进行10%福尔马林固定后，用10% EDTA脱钙，每日更换新鲜液，直至组织软化为止约3～4周。脱钙后流水冲洗24 h除酸，常规脱水、透明、浸蜡、切片。层厚4 μm，进行Safranin-O染色。显微镜下观察关节软骨细胞及细胞外基质的染色情况和结构的完整性，以及软骨纵裂或侵蚀的深度，并依据Safranin-O染色进行OARSI评分(见附表1)[10]。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 补肾活血方对小鼠关节肿胀度的影响

表1显示，测量小鼠右膝关节横径以分析其肿胀度变化，结果模型组小鼠右膝关节肿胀度于术后4、8、12周呈现显著上升(与假手术组比较，P<0.01)，表明模型组小鼠患侧膝关节存在持续的炎症反应；补肾活血方小鼠术后仍有关节肿胀，但已明显缓解(与模型组比较，术后8周，P<0.05；术后12周，P<0.01)。

表1 小鼠膝关节肿胀度变化比较

注：与假手术组比较：**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05；##P<0.01

3.2 补肾活血方对小鼠淋巴管回流功能影响

图1表2显示，ICG微注射入膝关节腔后使用NIR-ICG系统行淋巴管功能检测，记录其ROI(region of interest，箭头所示)区域ICG信号强度并使用Image J行定量分析；同时记录分析ICG 清除率(ICG clearance)及达峰时间(Tmax)。术后12周，模型组小鼠淋巴管回流功能明显减弱，表现为ICG清除率显著下降(6 h、12 h及24 h，与假手术组比较，P<0.05或P<0.01)，ICG达峰时间Tmax延长(与假手术组比较:P<0.01)；补肾活血方可改善小鼠ICG清除率(与模型组比较，6 h为P<0.05，12 h及24 h为P<0.01)，同时可缩短ICG达峰时间Tmax(与模型组比较:P<0.01)，表明其小鼠淋巴管回流功能得到改善。

3.3 补肾活血方对小鼠膝关节组织病理学的影响

图2表3显示，石蜡切片、 Safranin-O染色后镜下观察， 假手术组小鼠关节软骨表面光滑、完整，软骨层无裂缝、侵蚀；软骨细胞规则排列于软骨陷窝内呈柱状排列，软骨细胞数量、形态无异常；模型组小鼠术后12周呈现OA典型表现，包括软骨裂隙(红箭头)、关节游离体(绿箭头)及关节软骨丢失(黑箭头)，补肾活血方组小鼠术后12周软骨丢失明显改善；其OARSI评分亦显著下降(与模型组比较，术后12周，P<0.05)、关节软骨丢失面积亦有所减少(与模型组比较，术后12周，P<0.01)，提示补肾活血中药可有效延缓关节退变。

注：ICG微注射后使用NIR-ICG系统显影成像，记录其ROI(region of interest，箭头所示)区域ICG光信号强度并使用Image J行定量分析。图中显示注射后1、6、12及24 h后ICG强度在各组变化情况图1 小鼠膝关节淋巴回流功能检测

4 讨论

众所周知，关节周围物质和能量代谢“动态平衡”是保证关节正常功能的关键。维持这种“动态平衡”主要依赖于淋巴管。淋巴管包括毛细淋巴管及成熟淋巴管2种，它们在形态、细胞组成及功能上均存在差异。毛细淋巴管主要由排列疏松的淋巴管内皮细胞组成，而成熟的淋巴管除有紧密吻合的淋巴管内皮细胞外，外层还覆盖可特异性表达a平滑肌蛋白，并具有收缩功能的淋巴管平滑肌细胞，而管腔内还有防止淋巴倒流的瓣膜，淋巴管平滑肌细胞收缩和瓣膜共同构成“淋巴泵”，促进淋巴回流以协助单向收集淋巴液[11-12]，最后流入静脉，是组织液流入血液的媒介，被称为“第二循环系统”。淋巴系统的回流功能正常与否取决于其结构是否完整，尤其是成熟淋巴管的数量分布。

表2 各组小鼠淋巴管回流功能比较

注：与假手术组比较：*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01

表3 各组小鼠膝关节组织病理学变化

注：与假手术组比较：*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01

注：石蜡切片， Safranin-O染色后镜下观察。模型组术后12周呈现OA典型表现，包括软骨裂隙(红箭头)、关节游离体(绿箭头)及关节软骨丢失(黑箭头)，补肾活血方组术后12周软骨丢失明显改善图2 小鼠膝关节组织病理学检测

一直以来(1990年前)，OA被认为是“磨损”(wear and tear)导致关节软骨破坏形成的骨关节病。随着研究的逐渐深入，目前已公认OA是一种炎症性疾病而非单纯的骨关节病[13]。早在2010年，Zhou等[14]利用吲哚菁绿(indocyanine green，ICG)近 红 外(near Infrared，NIR)淋巴成像技术，检测急慢性炎性关节炎(包括OA及RA等)的淋巴管回流功能，提示在炎性关节炎过程中淋巴管功能发生改变。Xu H等[15]、Walsh DA等[16]及Shi[3]等的研究中，在OA患者关节滑膜组织中伴随淋巴管数量、结构及功能改变；而在OA小鼠关节周围毛细淋巴管增加，但成熟淋巴管形成减少、淋巴回流下降，同时伴随软骨下骨髓水肿；由此可见，淋巴增生可能是OA重要的病理机制之一，而促进增生的毛细淋巴管成熟，增强其淋巴回流功能，将炎症介质及时清除将是OA治疗的新方向。已有研究结果表明，改善淋巴回流功能有利于TKA(终末期OA)术后患者的恢复[2]；Zhou等[17]采用重组过表达血管内皮生长因子-C(vascular endothelial growth factor-c，VEGF-C)腺病毒，注射到同为炎性关节炎的RA小鼠踝关节内，3个月后其淋巴回流功能增强，淋巴管生成增加，同时踝关节内滑膜炎症减轻。Zgraggen 等[18]的研究同样证实，淋巴管的生成参与慢性炎症、过敏性疾病等过程。2015年Liang等[19]的研究表明，阻断淋巴管生成及淋巴回流功能，无论是小鼠RA还是OA，其病情均明显加快加重，与中医“痹症”的发病类似。

中医对于“痹病”(OA)病因病机的阐述最早见于《黄帝内经》。《素问·痹论》指出：“风寒湿三气杂至，合而为痹也。其风气胜者为行痹，寒气胜者为痛痹，湿气胜者为著痹也。”认为该病的主要病因是正气不足、风寒湿邪侵袭所致。以内因肝肾气血亏虚、风寒湿邪外袭、痰湿互结、痹阻经络为主要病因病机，因此扶正祛邪、补肾活血通络为其重要的治疗法则。补肾活血方是依据传统中医理论结合上海许氏伤科经验拟定而成，已应用临床多年且疗效确切[4-5]。方中骨碎补、补骨脂、熟地黄、怀牛膝补益肝肾，强筋壮骨；黄芪、当归补益气血；鸡血藤、水蛭活血破瘀；甘草调和诸药，诸药合用共奏补益肝肾、活血逐瘀之功。现代研究亦发现，补肾活血通络类中药可有效抑制炎性因子，如白细胞介素-1、6，肿瘤坏死因子-α等分泌，阻断骨关节炎症反应[20]，降低关节一氧化氮水平，延缓关节退变[21-22]，其具体靶点尚无定论。本研究结果显示，补肾活血方可有效改善OA模型组小鼠膝关节肿胀度，降低其OARSI评分，延缓关节退变，同时促进淋巴管回流功能，在ICG达峰时间缩短的同时，淋巴管清除率上升，证实补肾活血方治疗组淋巴管功能有所改善，清除能力得到提高。这些初步研究提示，淋巴管有可能是该方消肿及延缓关节炎症及软骨退变的可能机制，即促进淋巴回流而改善膝关节内环境代谢障碍(炎症介质蓄积)，促进局部微循环，加速炎症介质及分解酶类，如基质金属蛋白酶及整合素样金属蛋白酶与凝血酶等有害物质的代谢，从而达到消除关节肿胀、延缓关节退变的作用。无须讳言，淋巴功能和OA相关性的研究目前仍属于相对较新的领域，其中还有很多问题尚未厘清。如OA炎症与淋巴管增生和功能究竟存在何种因果关系？补肾活血中药如何影响淋巴管生成和淋巴回流功能，其中的分子机制是什么，又是通过哪些信号通路实现的，这些问题急需进一步解决。之后本课题组将对补肾活血方中中药各主要有效成分进行系统分析，利用基因芯片等技术对其靶基因、信号通路分子进行筛选验证，深入探讨其对淋巴管增生、成熟及回流功能的作用效应、靶点及其相关物质基础，以便探索其延缓OA的淋巴机制，解密其“除痹”密码。