心康冲剂基于调控PTEN-AkT-MMP-2蛋白表达抗心肌纤维化研究❋

刘蓉芳，孙 玲，张杼惠，杨 婷，吴玲娇，聂孝平，刘建和，毛以林Δ

(1. 江门市五邑中医院，广东 江门 529000； 2. 湖南中医药大学第二附属医院，长沙 410005； 3. 湖南中医药大学第一附属医院，长沙 410007)

心康冲剂是我院心内科临床效方，前期实验证明心康冲剂具有抗肾上腺素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)作用，能改善心脏病理结构，保护心肌细胞，提高心功能作用[1]。

心肌纤维化(myocardial fibrosis MF)是心肌正常组织结构中胶原纤维过量积聚导致胶原浓度显著升高或胶原成分发生改变的病理现象，是心功能不全的重要病理因素之一。定位于人类第10号染色体[2]的磷酸酶及张力蛋白同源基因PTEN，对成纤维细胞生长发挥着重要的作用，实验证明PTEN在心肌纤维化的病理过程中起重要作用。PTEN通过水解PIP3第3位磷酸基团对PI3K/AkT通路发挥抑制作用[3]，故PTEN基因缺失可激活AkT，从而诱导心肌成纤维细胞MMP表达升高[4]，引起心肌纤维化。探讨中药治疗慢性心衰、抗心肌纤维化的效用机制，有利于指导临床并提高临床疗效。因此本实验欲探索心康冲剂抗心肌纤维化的机制，现报告如下：

1 材料

1.1 实验动物

湖南斯克达实验动物有限公司提供90只SPF级SD大鼠(实验动物合格证号43004700025095)，体质量150～180 g，雌雄各半。

1.2 药品及仪器

芪苈强心胶囊(石家庄以岭药业)，心康冲剂(湖南省中医院中药制剂室制备)，盐酸阿霉素(深圳万乐)，MMP-2(美国proteintech，Rabbit),actin(美国proteintech，Mouse)，AKT(美国CST，Rabbit),一抗试剂盒PTEN(美国proteintech，Rabbit)，二抗HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(美国proteintech)，引物(上海生工合成)，LEICA DM LB2型双目显微镜(德国LEICA公司)，Motic B5 显微摄像图像分析系统(麦克奥迪)，便携式彩色多普勒超声仪(徐州大为DW-PF522)。

2 方法

2.1 动物分组及造模

大鼠适应饲养1周，按随机数字表法取10只为正常组，余下大鼠行阿霉素造模，造模方法参考文献[5]，以阿霉素按1.5 mg/kg体质量腹腔注射，每周2次共7周。7周后以超声心动图检测左心室短轴缩短率(LVFS)<30%[6]，即为心衰造模成功；模型成功后再按随机数字表法分为阿霉素模型对照组(模型组)16只，心康冲剂等效剂量组(低剂组)16只，心康冲剂2倍等效剂量组(中剂组)16只，心康冲剂4倍等效剂量组(高剂组)16只，芪苈强心胶囊对照组(对照组)16只。

2.2 药物制备及给药

心康冲剂溶液配制：白参10 g，柴胡5 g，生黄芪30 g，升麻5 g，桂枝6 g，茯苓15 g，桔梗5 g，薏苡仁30 g，陈皮10 g，制附片10 g，大腹皮10 g，生姜皮10 g，砂仁6 g，经湖南省中医院药剂科制成干燥颗粒后，配制成浓度分别为0.6 g/ml、1.2 g/ml、2.4 g/ml的溶液，分别设为心康冲剂低、中、高剂量组，芪苈强心溶液浓度配置为0.073 g/ml，设置为对照组，大鼠给药剂量按人和动物体表面积折算[7]，灌胃量=给药剂量/各组相应溶液浓度，每次灌胃约1～2 ml。正常组、模型组给予等量生理盐水灌服，每天1次。8周后实验结束进行取材。

2.3 指标及检测方法

2.3.1 Masson染色及胶原容积分数(CVF)测定 石蜡切片厚4～5 μm，经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水、水洗后用Weigert苏木精液染核5～10 min，依次盐酸酒精分化、蒸馏水漂洗、酸性丽春红染5～10 min。再用2%冰醋酸水溶液浸泡数秒，l%磷钼酸水溶液分化3～5 min，亮绿液染5 min，最后依次用梯度脱水，二甲苯透明、封片。应用Image-Pro 6.2图像分析软件系统分析大鼠心肌组织的胶原容积分数(collagen volume fraction，CVF)。随机精选出10个无血管的视野并观察其胶原面积(血管周围胶原面积避免计算在内)，各测量数据由计算机自动统计得出，CVF=视野内心肌胶原面积/视野总面积，最后取平均值。

2.3.2 Real-time PCR法检测PTEN mRNA表达 取大鼠左心室心尖部分适量，Trizol法提取大鼠心脏组织总RNA，行RNA琼脂糖凝胶电泳。取2 μg以组织总mRNA为模板，逆转录cDNA，42℃孵育15 min，85℃孵育5 min冰上冷却。以各检测基因引物(引物序列如下)进行实时定量PCR。定量PCR扩增条件，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 60 s，40个循环。收集每循环第3个步骤荧光信号量，以2-ΔΔCt反映各样品相对于对照组样品目的基因的表达水平，-ΔΔCt=对照组ΔCt-各样品ΔCt，△Ct=目的△Ct-内参△Ct。每个样本重复3次然后进行统计分析。

在NCBI上搜索PTEN基因的序列，primer5软件设计引物，由上海生工合成。

表1 引物序列表

2.3.3 Western blot 检测心肌组织PTEN、AKT、P-AKT、MMP-2蛋白质表达 剪取0.25 g左心室心尖组织加入200ulRIPA裂解液蛋白裂解，4℃ 12000rpm离心15 min，取上清分装离心管中；按照BCA蛋白定量试剂盒(Wellbio)使用说明操作，测定蛋白浓度。然后电泳、转膜、封闭、一抗孵育，用1×TBST将一抗按照一定比例稀释，PTEN(Rabbit，1∶1000)、AKT(Rabbit，1∶1000)、P-AKT(Rabbit，1∶1000)、MMP-2(Rabbit，1∶200)，actin(Mouse，1∶4000)，将膜与一抗一起孵育，4℃过夜。孵育结束，1×TBST洗3次，每次15 min。，然后二抗孵育用1×TBST稀释HRP标记的二抗(Proteintech)，稀释比例鼠抗(M)1∶4000，兔抗(R)1∶6000，将稀释后的二抗与膜共同孵育45～60 min。孵育结束，1×TBST洗3次，每次15 min。最后显色、曝光，使用ECL化学发光液(Thermo)与膜孵育3 min，用吸水纸吸尽液体，用保鲜膜将膜包裹杂交膜，在暗盒内与X胶片曝光数秒至数分钟，显影冲洗。将曝光后的底片扫描，并用quantity one专业灰度分析软件进行分析。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 Masson染色及心肌胶原纤维容积比(CVF)

表2图1显示，显微镜(400×)下可见正常组大鼠心肌肌纤维呈红色，胞核呈灰蓝色或者灰黑色。模型组可见以蓝、绿色胶原纤维呈网状排列为主，中间夹杂极少量红色肌纤维，CVF明显增大(P<0.05)；心康低剂、中剂、高剂量组及芪苈强心组蓝、绿色胶原纤维组织较模型组相对较少，CVF显著下降(P<0.05)；心康低剂、中剂、高剂量组与芪苈强心组比较差异无统计学意义(P>0.05)；心康低、中、高剂量组内比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组大鼠CVF及PTEN mRNA表达比较

注：与正常组比较：*P<0.05；与模型组比较：△P<0.05；与对照组比较：▲P<0.05；与心康低剂量组比较：▼P<0.05；与心康中剂量组比较：#P<0.05(CVF：胶原纤维容积比值；PTEN：人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因)

正常组；模型组；心康低剂组；心康中剂组；心康高剂组；对照组图1 MASSON 染色(取材左心室横切面，400×光镜)

3.2 各组PTEN mRNA表达差异比较

表2显示，与正常组比较，模型组大鼠PTENmRNA表达下降(P<0.05)；与模型组比较，心康低、中、高3组PTENmRNA表达升高(P<0.05)；与对照组比较，心康冲剂高剂量组基因表达增多明显(P<0.05)，心康冲剂低、中剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3.3 各组大鼠PTEN、AkT、p-AkT、MMP-2蛋白表达差异比较

表3显示，与正常组比较，模型组PTEN蛋白表达减少(P<0.05)，AkT、p-AkT、MMP-2蛋白表达升高(P<0.05)。与模型组比较，心康低、中、高剂量组及对照组PTEN蛋白表达增加(P<0.05)，AkT、p-AkT、MMP-2蛋白表达均下降(P<0.05)；与对照组比较，仅心康高剂组PTEN表达减少而MMP-2升高(P<0.05)，余心康低、中剂量组各蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)；与心康低剂量组比较，心康中剂量组各蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)，仅心康高剂组PTEN表达减少而MMP-2升高(P<0.05)；与心康中剂量组比较，心康高剂组PTEN表达减少而MMP-2升高(P<0.05)。

表3 各组大鼠PTEN、AkT、p-AkT、MMP-2蛋白表达比较

注：PTEN：人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因；AkT：总蛋白激酶B；p-AkT：磷酸化蛋白激酶B；MMP-2：基质金属蛋白酶-2；与正常组比较：*P<0.05；与模型组比较：△P<0.05；与对照组比较：▲P<0.05；与心康低剂量组比较：▼P<0.05；与心康中剂量组比较：#P<0.05

图2 PTEN、AkT、p-AkT、MMP-2蛋白质电泳图

4 讨论

临床上中药治疗慢性心衰疗效突出。慢性心衰在古代文献中尚无相关病名，而是根据症状将其类属于古医籍“水肿”“喘证”“心悸”范畴。现代临床医家普遍认为慢性心衰的病因病机是心肾阳气虚为本，血瘀、水饮、痰浊为标[8-9]。芪苈强心胶囊由葶苈子、黄芪、桂枝、人参、红花、丹参、附子、玉竹、泽泻、香加皮、陈皮组成，具有活血通络、益气温阳、利水消肿作用，是目前临床公认的治疗顽固性心衰的有效药物，被2014年《JAcc》主编A NDeMaria教授评为2013年度亮点[10]。

心康冲剂以真武汤、升陷汤及参苓白术散为基础方，具有“大补宗气、温补肾阳、健脾渗湿、温阳化气”[11]功效。方中白参、黄芪为君，升补宗气；茯苓、薏苡仁为臣，健脾利水；生姜皮、大腹皮利肌肤之水；砂仁化湿运脾；陈皮理气；制附片温阳化饮；桂枝温阳化气为佐；柴胡、升麻提升清阳之气；桔梗为舟揖之药，载诸药上达而至病所为使，共奏“升补宗气、温阳利水”之功。

PTEN具有磷脂和蛋白质的双重磷脂酶活性[12]，AkT称蛋白激酶B，其羧基端的调节域含有磷酸化位点Ser473，AkT完全活化需要该位点的磷酸化[13]，即p-AkT是AKT活化的功能形式，被激活后发挥调节细胞迁移、生长、增殖及凋亡等作用[14]。基质金属蛋白酶家族(MMPs)多由平滑肌细胞、成纤维细胞、哺乳动物的心肌细胞分泌，可能参与细胞外基质的沉积，与动脉硬化、结缔组织病及脏器的纤维化等[15]有关。研究发现[16]，MMPs表达增高常伴有组织纤维化，心力衰竭患者的MMP活性增强，且与进行性的左心室增大有关。PTEN蛋白通过脂质磷酸酶活性去磷酸化二磷酸肌醇和三磷酸肌醇从而负性调节AkT，成纤维细胞过表达PTEN的mRNA和蛋白能抑制AkT及其下游的基因MMPs[17]，使胶原基因转录和合成受阻。相反如果PTEN基因缺失或减少则会激活AkT，促使心脏成纤维细胞分裂增值加速，导致心肌纤维化。因此，PTEN是AkT/MMPs的“分子开关”[18]，在成纤维细胞的生长增殖与降解过程中起到关键的调节作用。

本实验中，Masson染色示阿霉素腹腔注射后心衰大鼠纤维化心肌，表现在心肌切片可见胶原纤维呈网状排列，同时PTENmRNA及蛋白表达下降及AkT、p-AkT、MMP-2蛋白质表达升高，再次证明心肌纤维化病理过程具有PTEN表达下降及AkT、p-AkT、MMP-2表达升高的特征。心康冲剂低剂量、中剂量、高剂量能减轻心肌纤维化，上调PTEN表达，下调AkT、p-AkT、MMP-2表达，从而逆转心肌纤维化的作用，心康冲剂这种抗心肌纤维化作用与芪苈强心胶囊相当。然而心康冲剂低、中、高剂量各组在调节PTEN/AkT/MMP-2分子上并未出现剂量-效应递增关系，分析其原因是否存在相关药物受体耗竭的可能，尚未可知。且心康冲剂高剂量组MMP蛋白质表达均较心康冲剂低、中剂量组明显升高，而PTEN蛋白质表达较之明显下调，说明心康冲剂低、中、高剂量在抗心肌纤维化及干预PTEN/AkT/MMP-2分子作用中存在剂量差异性。从整体功效看，心康低、中剂量在调节PTEN/AkT/MMP-2各分子表达上更有优势。临床应用中药治疗慢性心衰既可以提高临床疗效，也可减轻西药的副作用。本实验证明，心康冲剂具有抗心衰心肌纤维化的作用，可为中药新药开发提供一定的依据。