粪便生物标志物在炎症性肠病诊疗中的应用进展

郑 静，张 铁，韩呈武 综述，曹永彤 审校

(中日友好医院检验科，北京 100029)

炎症性肠病(IBD)是一类慢性非特异性肠道炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎(UC)、克罗恩病(CD)及少部分未分类结肠炎。IBD最常见临床表现为反复腹痛、腹泻、黏液血便，病程迁延，缓解与复发交替，没有根治方案，严重影响患者的健康和生活质量。近年来，IBD在我国发病率呈逐年上升趋势[1]。内镜和组织病理检查是评价IBD疾病活动度的金标准，但内镜检查是一项侵入性检查，需要做肠道准备，且耗时长、费用高，对患者，尤其是儿科患者是一种痛苦的体验。因此，需要一种或一类无创、可靠、方便、经济的能准确反映肠道炎症活动性的标志物来协助IBD的诊疗和动态监测。目前，临床常用于评估IBD疾病活动度的实验室标志物主要有C反应蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)及降钙素原(PCT)等。但是这些指标多综合反映全身炎症，特异度及灵敏度有限。而粪便生物标志物(FM)因与肠道黏膜直接接触，在反映肠道黏膜炎症方面可能更为准确和灵敏，对于IBD的诊疗具有重要意义[2]。目前用于IBD诊疗研究较多的FM是粪钙卫蛋白(FC)和粪乳铁蛋白(FL)，也有部分研究表明S100A12、丙酮酸激酶(PK)M2型(PKM2)、基质金属蛋白酶(MMP)、新喋呤、白细胞介素(IL)-1、IL-6、IL-17A及肿瘤坏死因子(TNF)-α可作为IBD的FM[3-4]。下面就FM在IBD诊疗中的应用进展进行综述如下。

1 可应用于IBD诊疗的FM概述

1.1FC 钙卫蛋白是一种相对分子质量为3.6×104的钙锌结合蛋白，是由两个异源钙结合蛋白(S100A8和S100A9)组成的二聚体，属于S100蛋白家族成员，主要来源于中性粒细胞，占其细胞质蛋白的60%，小部分来源于单核细胞和活化的巨噬细胞[5]。在IBD中，尤其在活动期，黏膜中炎症细胞浸润明显，脱落入肠腔，导致粪便中FC明显升高。FC在粪便中匀质存在，能抵抗细菌和蛋白酶降解作用，在室温下性质稳定，最长可保存1周，可用酶联免疫吸附试验进行定量检测[4]。研究发现FC与IBD疾病活动指数和内镜下活动度评分相关，且灵敏度和特异度均高于CRP[6]。中华医学会消化病学分会《IBD诊断与治疗的共识意见(2012年·广州)》中建议有条件可将FC作为辅助检查[7]。

1.2FL 乳铁蛋白是一种相对分子质量为8.0×104的糖蛋白，可与铁结合，属于转铁蛋白家族。乳铁蛋白主要储存在于中性粒细胞、单核巨噬细胞和肠道内皮细胞中，它通过限制铁利用来抑制细菌的生长。在炎症状态下，中性粒细胞和单核巨噬细胞释放乳铁蛋白，因此可以作为一种炎性标志物。FL能抵抗蛋白酶水解作用，在室温下性质稳定，可用酶联免疫吸附试验定量检测[4]。研究表明，FL在IBD患者中明显升高，中度CD或UC患者FL的水平均高于轻度或缓解期患者[8]。

1.3新喋呤 新喋呤是人体内三磷酸鸟苷代谢、四氢生物喋呤合成过程中产生的一种低分子嘧啶化合物。主要由活化的T淋巴细胞分泌的IFN-γ刺激单核-巨噬细胞产生，是反映体内淋巴细胞-巨噬细胞轴所介导的细胞免疫状态的主要标志物[9]。据报道，在一些免疫介导的炎症性疾病中，如移植物抗宿主病、类风湿性关节炎、脓毒败血症、系统性红斑狼疮、急性胰腺炎等疾病，患者血液和尿液标本中的新喋呤会明显升高[10]。有研究表明粪便新喋呤也是评价IBD活动性的一种可靠的生物标志物，且其在预测IBD患者内镜下疾病活动性的准确性与FC相当[11]。

1.4MMP-9 MMP是一种含锌离子催化中心的肽链内切酶，参与降解细胞外基质和基底膜，从而引起组织或器官损伤。MMP-9 主要由结肠上皮细胞和中性粒细胞释放，参与细胞外基质(ECM)的降解，造成肠黏膜组织的损伤[12]。研究表明UC患者肠黏膜MMP-9表达明显增高，不同活动度组间表达差异有统计学意义(P<0.05)，提示UC患者肠黏膜MMP-9表达上调与严重度相关[13]。KOLHO等[14]研究显示活动期IBD 患者粪便中MMP-9水平明显升高，并且UC患者高于CD患者。粪便MMP-9为黏膜损伤的一项标志物，可用来评价UC患者的黏膜炎症和损伤情况。

1.5S100A12 S100A12是S100蛋白家族成员之一，主要表达于中性粒细胞，占其细胞质蛋白的5%，小部分来源于单核细胞和巨噬细胞等。S100A12具有上调内皮细胞黏附分子、活化并趋化炎性细胞和抗菌活性等功能[3]。KAISER等[15]研究发现IBD患者粪便中S100A12平均水平高于对照组和肠易激综合征(IBS)组,且活动期高于缓解期。HEIDA等[16]也发现与健康个体相比，初诊儿童和青少年IBD患者的粪便S100A12明显增高。目前S100A12应用于IBD诊疗的研究相对较少,未来尚需要更多研究来评估其在IBD诊疗中的应用价值。

1.6PKM2 PK是细胞糖酵解通路的关键酶。人体内PK有L、R、M1和M2共4种同工酶，其中L型主要表达在代谢旺盛的肝脏、肾脏和小肠等组织，R型主要表达于红细胞,M1型表达于肌肉和脑，M2型表达于胚胎组织、干细胞和肿瘤细胞[4]。早前PKM2的研究主要集中在肿瘤的筛查和早期诊断，近来人们发现IBD患者粪便PKM2水平明显高于健康志愿者。PKM2可以在粪便中稳定存在2 d，稳定性略逊于FC和FL[17]。

1.7其他 尽管IBD发病机制尚未研究清楚，但研究表明炎性因子和趋化因子，如IL-1、IL-6、IL-17A和TNF-α等参与了IBD 的炎性反应，其在粪便中的水平可能在一定程度上反映IBD 疾病活动性[4]。另外，肠道微生物感染在IBD发病中起重要作用。FUKUDA等[18]通过末端限制片段长度多态性(T-RFLP)的方法分析UC 患者和健康对照组的肠道微生物群，通过判别分析，发现判别分数(Ds)随疾病活动性增加而降低，可能成为UC疾病活动性的生物标志物。这些FM由于本身性质不稳定，或没有简便易行的检测手段，相关研究较少，目前并没有应用于IBD临床诊疗。

2 FM在IBD诊疗中的应用

2.1应用于IBD的诊断和鉴别诊断 IBS的临床表现与IBD类似，但IBS患者无肠道炎症细胞浸润，而IBD患者肠道黏膜存在程度不等的中性粒细胞浸润，故中性粒细胞来源的炎性标志物可以用来鉴别IBD和IBS。VAN RHEENEN等[19]进行的一项纳入6个成人研究(670例)和7个儿童研究(371人)的Meta分析表明FC能够准确鉴别IBD与IBS。在成人中，FC诊断IBD的灵敏度为93%，特异度为96%；在儿童和青少年中，其灵敏度和特异度分别为92%和76%。通过FC筛查将使67%的成人和35%的儿童避免不必要的内镜检查，但由于假阴性结果，6%的成人和8%的儿童可能会诊断延迟。KOLHO等[14]发现，FC可以较好地鉴别儿童IBD和非IBD患者，灵敏度为81.8%，特异度为96.3%，受试者工作特征曲线下面积(AUC)为0.944 (95%CI为 0.907～0.981)。而BORKOWSKA等[8]发现FL(>13.3 μg/ g)区分儿童IBD和对照组的灵敏度和特异度分别为80.7%和92.7%。MENEES等[20]的Meta分析表明CRP≤0.5 mg/dL或FC≤40 mg/ kg基本上可以从存在IBS症状的患者中排除IBD。MINISTRO等[2]认为以临床区分IBS与IBD为目的设定cut-off值，FC<50 mg/kg为阴性，50～150 mg/kg为弱阳性，>150 mg/kg为阳性；FL<7.25 mg/kg可考虑为阴性。KAISER等[15]研究发现IBD患者粪便中S100A12平均水平高于IBS患者，在鉴别IBD和IBS方面其灵敏度、特异度分别为86%和96%。ANNAHAZI等[12]研究显示UC患者的粪便 MMP-9明显升高，cut-off值为0.245 ng/mL时可以较好地区分UC 和IBS或健康志愿者，灵敏度为85.1%，特异度为99.99%，AUC为0.939。尽管各类研究的病例人群有差异，各标志物的单位不统一，cut-off值差异很大，但大多数研究数据表明，IBD患者的FM水平高于健康人群，可考虑用于疑似IBD患者的初筛。

2.2评价IBD疾病活动度 在IBD活动期，黏膜表面炎症细胞浸润明显，相应的粪便中炎症细胞和炎性因子增多。研究表明，活动性IBD患者中FC水平明显升高，并与内镜及组织病理学观察到的肠道黏膜炎症浸润程度一致。ZITTAN等[21]发现，在UC患者中，FC与临床Mayo评分和内镜下Mayo评分相关(r=0.63和r=0.96，P<0.000 1)；在CD患者中，FC与内镜下疾病活动度相关(r=0.61，P<0.000 1)。SCHOEPFER等[6]的研究显示，FC>50 mg/kg预测黏膜炎症的灵敏度为93%，特异度为71%。FC与内镜下疾病活动度相关性最高，优于其他临床指标，包括CRP、白细胞和CD活动指数(CDAI)等。LABAERE等[22]则发现FC检测轻度UC的灵敏度为71%～100%，检测中度至重度UC的灵敏度为100%，特异度为67%～86%；而在CD中，FC只能区分缓解和中度至重度疾病，灵敏度为83%～86%，特异度为75%。但SHIMOYAMA等[23]在122例无结肠受累的CD患者中的研究表明FC水平与小肠炎症程度呈正相关。

除了FC，FL和MMP-9也被证明与IBD疾病活动度相关。SIPPONEN等[24]的研究发现FL与内镜下疾病活动度相关，灵敏度为66%，特异度为92%，优于CDAI或CRP。ANNAHAZI等[12]的研究则提示在评估IBD疾病活动度方面MMP-9要优于FC，其与Mayo评分和内镜下活动度均相关。cut-off值为2.38 ng/mL时，MMP-9可以较好地区分活动性和缓解期UC,灵敏度为97.1%，特异度为83.3%。FM(如FC、FL、MMP-9等)水平与IBD内镜下评分及临床指数等具有较好的相关性，可以辅助内镜检查，用来评估IBD疾病活动度，监测疾病进程。

2.3评价疗效 目前，IBD患者的治疗目标已经由临床症状缓解转向达到肠道黏膜愈合，但尚没有黏膜愈合的统一定义，其主要评价方法是内镜及病理组织学检查。一般认为黏膜愈合的标准为Mayo评分为0。KIM等[25]通过病例回顾性研究发现，UC患者中黏膜愈合者(Mayo评分0)较未达到黏膜愈合的患者临床缓解期更长。

研究发现FC和FL是黏膜改善的可靠标志物，内镜显示对治疗有应答者的FM趋于正常，而在大多数内镜下无应答者FM仍然异常[26]。GUIDI等[27]发现，对TNF-α治疗有应答者FC水平低于无应答者。FC≤168 μg/g预测持续的临床反应性的灵敏度为83%，特异度为76%。预测黏膜愈合(FC≤121 μg/g)的灵敏度和特异度分别为79%和57%。而HASSAN等[28]检测了44例难治性UC患者接受英夫利昔单抗治疗前后的血清和粪便的生物标志物，发现在所有测试参数中，FC对临床缓解(AUC=0.826)和黏膜愈合(AUC=0.949)具有最好的预测价值。YAMAGUCHI等[29]也得到类似结果，FC预测Mayo 0/1的AUC为0.869，优于CRP、ESR等指标。PATEL等[30]发现在UC中，FC≤60 μg/g可以预测深度缓解(AUC为 0.92，灵敏度为86%，特异度为87%)和更深度缓解(AUC为0.91，灵敏度为83%，特异度为90%)。上述研究表明，FC在一定程度上可以作为内镜的替代指标，用于评价患者对治疗方案的反应性，及时调整治疗方案；同时也可用于预测临床缓解和黏膜愈合。

2.4预测疾病的复发 缓解期IBD虽然没有症状，但肠黏膜炎性浸润可能依然存在，当炎症细胞数达到一定阈值后，就会复发。FM能够检测到临床症状不明显的黏膜炎症，且与IBD内镜下评分具有较好的相关性，因此可用于预测复发风险[3,5]。LOBATON等[31]检测内镜下提示炎症活动的无症状患者的FC，发现81.8%的患者FC水平≥280 μg/g。GARCIA-SANCHEZ等[32]对135例IBD临床缓解患者的前瞻性病例对照研究显示，复发患者的FC水平(444 μg/g)高于维持缓解者(112 μg/g，P<0.01)。FC>200 μg/g的CD患者复发的风险比低FC水平患者高4倍；而FC>120 μg/g的UC患者复发的风险比低FC水平者高6倍。GISBERT等[33]长期随访163例临床缓解期IBD患者，结果发现复发患者FC水平[(239±150)μg/g]高于持续缓解者[(136±158)μg/g，P<0.001],高FC(>150 μg/g)或FL阳性的患者复发风险更高。TIBBLE等[34]发现FC(>50 mg/L)预测IBD复发的灵敏度和特异度分别为90%和83%。OSTERMAN等[35]研究表明在FC水平较高的缓解期UC患者中，增加美沙拉秦的剂量可降低FC水平，且复发率降低。高FC水平(> 200 μg/g)的患者较早出现临床复发。以上数据表明，FC或FL可用于预测IBD的复发，高水平的FC或FL提示复发风险较大。

2.5术后监测 近来多个研究证实FC可应用于IBD患者肠切除术后监测。YAMAMOTO[36]针对肠切除术后的CD患者的研究表明，FC水平升高的患者内镜下复发的发生率(75%)明显高于维持低水平的患者(9%)。 FC>140 μg/g对内镜下复发的预测灵敏度为75%，特异度为91%，阳性预测值(PPV)为75%，阴性预测值(NPV)为91%。WRIGHT等[37]也发现，结肠切除术后6个月疾病复发患者的FC水平(275 μg/g)大于持续缓解的患者(72 μg/g,P<0.001)，FC>100 μg/g预测内镜下复发的灵敏度为89%，特异度为58%。LOPES等[17]针对发生吻合口狭窄的CD患者研究发现，在评估内镜下复发方面，FC>90.85 μg/g的灵敏度为95.5%，特异度为69.2%，PPV为72.4%，NPV为94.7%；而FL>5.6 μg/g的灵敏度为77.3%，特异度为69.2%，PPV为68%，NPV为78.4%。因此，FC和FL可作为无症状吻合口狭窄的CD患者内镜下复发的良好预测指标。对于肠切除术后的IBD患者，术后连续监测FC或FL水平能有效预测疾病复发，减少不必要的内镜检查。

综上所述，FM相较于血清学标志物，对肠道炎性反应具有更好的灵敏度和特异度。大量研究数据证实，FM，尤其是FC，可用于协助诊断IBD，评估药物治疗效果，动态监测疾病活动度，并判断复发风险。

3 FM应用于IBD诊疗的局限性

尽管上述多项研究表明，FM对于IBD的鉴别、活动性判断、复发的预测及药物疗效的评估有很高的价值。但需要注意的是其在IBD诊疗中的应用也存在一定局限性：(1)特异度欠佳。以FC为例，在细菌等引起的感染性腹泻中，肠道功能不全及其他原因致肠道黏膜渗透性升高的情况下，FC水平也会明显升高；在结肠肿瘤患者中，FC水平也明显高于健康对照组。另外消化吸收状态，质子泵抑制剂(PPI)、非甾体抗炎药(NSAIDs)摄入均会影响检测结果[5]。(2)综合目前研究数据，FC 和 FL cut-off值范围很宽泛，灵敏度和特异度数据差异很大。可能有以下原因：(1)未细分疾病类型是UC还是CD；疾病部位在于结肠还是小肠；疾病活动度高还是低；术前还是术后等。(2)检测方法，LABAERE等[22]比较了6种FC的检测方法，发现不同检测方法的定量值相差5倍，说明检测方法需要设定统一的标准，规范化。 检测时间点不同。所以，在以后的研究中需要细分疾病类型、疾病活动度和检测时间点，这样才能得到更准确可信的数据。(3)使用FM来评估IBD患者治疗效果时，不同检测时间节点，反映的情况也不一样，故最佳检测时间节点是评价的关键。目前对于FM检测时间节点尚无统一意见，同一患者的连续检测可能对疾病的监测效果更好。

4 小结和展望

IBD易反复发作、病情迁延，疾病筛查、病程动态监测，极大影响患者的健康和生存质量。内镜及病理检查虽然具有较高的准确度和特异度，但因其有创性、痛苦体验和费用高，患者依从性较低，大大影响疾病的监测。FM检测标本采集和保存简便，无创且经济、客观，在IBD筛查、诊断、评估及随访中具有更大优势。IBD的FM包括FC、FL、新喋呤、PKM2、S100A12、MMP-9等，在IBD的诊疗中有良好的应用前景。但迄今尚未发现其中一种可以代替传统的内镜检查和病理检查。相信随着对IBD病因及机制研究的深入，检验技术的进步，将会发现更多具有高特异度、灵敏度的粪便标志物。