miR-370靶向作用TRAF-4对肺癌细胞增殖和凋亡的影响

张曦，陈文俊，黄选章，吴聪聪，林瑞芳，吴剑

肺癌是我国最为高发的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌占肺癌的 80%～90%，患者确诊后多为中晚期，而造成80%以上非小细胞肺癌患者死亡的原因是发生远处转移[1]。微小RNA（miRNA）是由内源性基因编码的单链非编码RNA分子，在细胞内发挥重要的调节功能，在人体的不同组织中miRNAs的表达水平存在显著差异[2]。miR-370是一种最早于人体胚胎干细胞中被克隆出的miRNA，目前发现其在多种恶性肿瘤中存在表达，参与了对肿瘤发生和进展的调控作用[3]，但其在非小细胞肺癌中的研究目前鲜有报道。本研究通过检测非小细胞肺癌组织和细胞系中miR-370的表达水平，研究其对非小细胞肺癌细胞增殖和凋亡的影响，并探讨其可能的作用靶点，为研究非小细胞肺癌发生发展的分子机制提供理论参考。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取 2015年 9月至2016年11月来温州医科大学附属第二医院就诊的非小细胞肺癌患者58例，其中男 37例，女 21例；平均年龄（48.2±4.1）岁；术前均未进行任何肿瘤相关治疗。取非小细胞肺癌组织和正常肺上皮组织新鲜标本，标本均经组织病理学确诊。肺癌细胞A549、SPC-A1、H460、GLC082和 PC-9及正常肺上皮细胞EBAS-2B均购自于中国医学科学院基础医学研究所。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR法检测miR-370的表达采用总RNA提取试剂盒（日本Takara公司）提取新鲜肺组织和肺癌细胞株中总RNA，反转录方法合成cDNA，并采取荧光定量PCR试剂盒（日本Takara公司）进行PCR反应，操作过程严格按照试剂盒说明书进行。PCR反应条件为95 ℃预变性 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃10 s，一共进行40个循环。所有反应设3个重复。RT-PCR 分析采用 2－△△Ct法，△Ct为目的基因与内参基因的CT值比较后再将实验组与空白对照组进行比较，即△△Ct=△CtmiR-370－△CtGAPDH。

1.2.2 CCK-8法检测miR-370对肺癌细胞增殖的影响 将肺癌细胞A549分为3组，分别转染 miR-370 mimics（miR-370模拟物组）、miR-370 inhibitor（miR-370抑制剂组）及无关序列（空白对照组），用胰酶将细胞消化5 min，按104个/孔将细胞接种于96孔板中，并置于37℃、5%的二氧化碳培养箱中进行培养 4 h。取不同时间点（24、48、72、96 h）采用CCK-8法对肺癌细胞A549的增殖能力进行检测，每组细胞设3个复孔并重复3次实验。

1.2.3 流式细胞术检测肺癌细胞凋亡用不含EDTA的胰酶消化肺癌细胞，将消化好的细胞进行离心10 min，离心条件为500 r/min，4℃；取出离心管后弃上清，加入标记缓冲液悬浮细胞；往细胞液中加入Annexin V-FITC（南京凯基生物公司），置于室温孵育15 min，避光。采用流式细胞仪检测肺癌细胞A549的细胞凋亡情况，每组重复3次。

1.2.4 双荧光素酶检测 将处于对数生长期的肺癌细胞 A549接种于96孔板中，每孔体积为100 l，置于二氧化碳培养箱进行孵育24 h，按照Lipofectamin 2000（美国Invitrogen公司）说明书进行细胞转染。48 h后取出细胞并更换培养基，震荡10 min后进行双荧光素酶实验，采用荧光计测定荧光值。

1.2.5 Western blot检测肿瘤坏死因子受体相关基因4（TRAF-4）蛋白的表达提取肺癌细胞株总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度。取50 g蛋白进行 SDSPAGE电泳，电泳后湿转移至PVDF膜，并放置封闭液中封闭1h，加TRAF-4兔抗人单克隆抗体（1∶1000），4℃孵育过夜，加入羊抗鼠二抗（1∶5 000），置于室温下摇床孵育1 h，采取ECL化学发光法显色。采用Image J图像处理软件进行图像分析，以TRAF-4/-tubulin灰度比值作为TRAF-4的相对表达水平。

1.3 统计方法 采用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，采用 检验或方差分析。＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-370在非小细胞肺癌组织和细胞中的表达 非小细胞肺癌组织中miR-370的平均相对表达量为（0.366±0.039），而癌旁正常组织中为（1.049±0.171），两组差异有统计学意义（t=12.948，P=0.001）。在非小细胞肺癌细胞 A549、SPC-A1、H460、GLC082和PC-9中，miR-370的相对表达量分别为（0.497±0.123）、（0.551±0.161）、（0.513±0.136）、（0.461±0.126） 及（0.378±0.061），与正常肺上皮细胞差异均有统计意义（t≥16.148，均P＜0.05）。

2.2 miR-370对肺癌细胞A594细胞生长的影响 miR-370在转染了 miR-370 inhibitor后表达显著降低，而在转染miR-370mimics后显著升高，见封二彩图6。转染第4天后，miR-370mimic肺癌细胞A549的活力显著低于空白对照组，转染 miR-370 inhibitor的细胞生长活力显著升高，与对照组和空白组差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见封二彩图7。

2.3 MiR-370对肺癌细胞凋亡的影响转染miR-370 mimics 72 h后，肺癌细胞A549的凋亡率从39.0%提高到76.1%，而miR-370 inhibitor组细胞的凋亡率则为 18.0%，显著低于空白对照组（=0.000）。见封三彩图1。

2.4 双荧光素酶报告基因检测TRAF-4 mRNA 3'-UTR与miR-370有互补结合位点，且得分最高。miR-370mimics与野生型 TRAF-4共转染组的细胞荧光素酶活性显著下降（P=0.004），而突变型共转染组荧光素酶活性则无明显变化。同时在miR-370 inhibitor组和空白对照组中未观察到荧光素酶活性变化，差异无统计学意义（P=0.112），见封三彩图2。

2.5 miR-370对TRAF-4蛋白表达的影响 细胞转染24 h后，转染 miR-370 mimics后TRAF-4蛋白的相对表达量为（0.31±0.05），而 miR-370 inhibitor组的TRAF-4相对表达量为（2.38±0.33），两组差异有统计学意义（t=3.286，P=0.012）。

3 讨论

miR-370是近年来发现在多种肿瘤中发挥调控作用的小分子RNA。研究表明，miRNA与非小细胞肺癌的发生、发展和迁移过程存在紧密联系[4]。陈小平[5]发现，miR-370在乳腺癌组织中表达水平是癌旁正常组织的近6倍，且其表达与患者肿瘤大小、临床分期及浸润程度呈正相关。Lo等[6]发现，miR-370在人胃癌组织中表达显著上调，且其可直接靶向作用于FoxM1基因，上调miR-370水平可促进胃癌细胞的增殖和侵袭能力。韩玲[7]发现，miR-370在非小细胞肺癌中的表达与细胞的黏附和转移密切相关，沉默miR-370的表达可显著升高肺癌细胞侵袭和转移，且可提高肺癌患者的生存率。TRAF-4是TRAF家族中一员，其主要参与肿瘤坏死因子受体（TNFR）家族的信号传导[8]。目前多项研究发现，TRAF-4在乳腺癌、肺癌和结直肠癌中高表达，通过基因载体的方式抑制TRAF-4的表达可降低肿瘤细胞的生长、侵袭和迁移能力[9-10]。Wu等[11]采用慢病毒感染的方式对结直肠癌细胞中TRAF-4的表达进行沉默，可抑制结直肠癌细胞SW620的增殖，同时对Akt的活化过程也有较强的抑制作用。Zhang等[12]在肺癌细胞中过表达TRAF-4，可发现肺癌细胞增殖能力显著增强，同时可增加S期细胞比例。

本研究结果显示，在非小细胞肺癌组织和肺癌细胞系中，miR-370表达均显著下调（均＜0.05），表明miR-370在非小细胞肺癌的发生发展过程中可能充当了抑癌基因的功能。在对肺癌细胞A549进行细胞转染后，可观察到miR-370mimics组在第3天开始生长速度显著降低，在第4天其生长速度显著低于空白组，表明miR-370可抑制肺癌细胞的增殖能力；流式细胞检测结果表明，空白对照组、miR-370 mimics组和miR-370 inhibitor组的细胞凋亡率分别为 39.0%、76.1%和18.0%，miR-370mimics组细胞凋亡率显著高于抑制剂组和空白组（均＜ 0.05），表明 miR-370对肺癌细胞的凋亡具有促进作用。双荧光素酶报告基因检测结果显示miR-370可直接靶向作用与TRAF-4蛋白，同时，Western blotting结果显示，miR-370mimics组肺癌细胞中TRAF-4的表达量显著低于空白组，而抑制miR-370的表达后，肺癌细胞A549中TRAF-4的表达则显著上调，这说明miR-370对肺癌细胞中TRAF-4的表达具有抑制作用。

综上所述，miR-370在非小细胞肺癌组织和细胞中低表达，过表达miR-370可抑制非小细胞肺癌细胞的生长，并促进细胞凋亡。因此，miR-370表达的显著下调对于非小细胞肺癌的诊断提供一定参考，同时也可能成为肺癌治疗的靶向分子之一。