顺铂诱导肿瘤细胞死亡中钙离子作用研究进展

张岳培,孙 伟,冯 静,黄艺锦,徐径舟,于 洋

(吉林医药学院:1.公共卫生学院，2.临床医学院，3.科研实验室，吉林 吉林 132013)

顺铂作为一种铂类化合物，是临床广泛应用于治疗实体瘤最有效的化疗药物之一。以往的研究显示顺铂的主要靶点是细胞核内的DNA，可以抑制DNA的复制。最新的研究表明顺铂不仅可以发挥DNA依赖的效应，也可以聚集在线粒体和内质网等细胞器发挥非DNA依赖的效应[1-3]。钙离子作为细胞内重要的第二信使，与细胞增殖、编程性死亡、肌肉刺激收缩、基因转录、信号传递等密切相关。而细胞内钙离子水平依赖于内质网的钙离子释放和来自细胞外空间的钙离子流入。在正常情况下钙离子促进细胞存活，但在顺铂刺激下，内质网钙离子释放增加，钙离子失衡诱导卵巢癌SKOV3细胞发生内质网依赖和线粒体相关的凋亡[4-5]。本文对钙离子在顺铂诱导肿瘤细胞氧化应激、自噬、凋亡过程中发挥的信号作用及相关机制的研究进行总结，为提高顺铂化疗肿瘤疗效提供参考。

1 钙离子和氧化应激

正常情况下机体内活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生和清除处于动态平衡状态，所以对机体并无有害影响。而多种外源性或内源性有害刺激可打破这种平衡，致ROS大量生成而超过抗氧化系统的清除能力，机体就会形成氧化应激状态[6]。有研究表明顺铂不仅可以诱导ROS产生，导致氧化应激，还可以破坏细胞内的钙离子平衡[7-8]。

线粒体是决定细胞生存和死亡的关键因素，其在转导和扩大死亡信号的过程中起着十分重要的作用。在凋亡的内源性途径中，线粒体的功能是作为凋亡途径的上游与胱天蛋白酶(caspas)、下游与死亡执行器之间的连接[9-10]。内质网中的钙离子和线粒体产生的ROS相互作用，一方面钙离子可以增加ROS的产生，另一方面ROS可以影响钙离子涌入细胞和钙库[11]。大量的ROS会损伤细胞内的大分子，损伤线粒体的结构和功能，进而加剧顺铂诱导的DNA损伤，触发线粒体依赖的凋亡途径。此外，通过抑制钙离子流入胞浆和进入线粒体，导致细胞内ROS减少，降低肿瘤细胞凋亡率[12-13]。在顺铂或ATP激动剂诱导下，与顺铂耐药细胞不同，卵巢癌skov3细胞胞浆中的钙离子水平更有效地增加。一旦胞浆中钙离子增加，就会影响线粒体中的钙离子水平，线粒体的钙离子过载触发线粒体依赖的凋亡途径[14]。

诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)是一种合成NO的关键酶，通过产生NO提高细胞内氧化水平[15]。钙离子和iNOS在细胞内关系密切。在肝细胞中，钙离子通过钙调蛋白依赖的激酶，降低了细胞因子介导的iNOS的表达[16]。细胞因子通过改变细胞内钙离子浓度，来诱导肝细胞中iNOS的表达。而钙离子信号通过下游许多蛋白激酶和转录因子可调控细胞内基因表达，进而来调控iNOS表达。iNOS作为钙离子的下游分子，还可以通过抑制参与顺铂诱导损伤的修复酶和提升细胞内顺铂的积累来提高顺铂毒性作用。研究表明，通过钙离子-iNOS通路提高了卵巢癌细胞的凋亡水平，降低了耐受性[15-17]。可见在顺铂诱导肿瘤细胞死亡下，钙离子调控氧化水平，导致肿瘤细胞死亡。

2 钙离子和自噬

自噬的主要生理功能是吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并将其包裹进囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，最终维持细胞稳态。在缺氧、缺乏营养、感染等情况下，引起自噬，来对抗刺激，使自身存活。但持续的刺激也会引起细胞死亡。顺铂诱导肿瘤细胞死亡中，可以伴随自噬发生，而钙离子参与其中自噬的调控。

在哺乳动物细胞中，内质网钙离子的储存和释放主要取决于内质网钙泵对钙离子的摄取，和肌醇三磷酸受体(inositol triphosphate receptor,IP3R)、雷诺定受体对钙离子的释放。有研究发现钙离子和自噬联系密切，钙离子对自噬发挥双向作用[18-19]。

2.1 钙离子诱导自噬

顺铂诱导肿瘤细胞死亡中钙离子可以诱导自噬的途径：①内质网释放的钙离子通过与细胞外信号调解激酶结合，使B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,BCL-2)蛋白磷酸化，进而Beclin1从Beclin1-BCL-2复合体上脱离，导致自噬的发生[20]；②钙离子活化死亡相关蛋白激酶(death-associated protein kinase，DAPK)，活化后的DAPK磷酸化Beclin1的BH3-ONLY域，进而介导Beclin1分离，发生自噬[21]；③蛋白激酶Cθ被证实以钙离子依赖模式参与内质网应激性的自噬调节[22]；④钙离子使钙调蛋白依赖的蛋白激酶β活化，进而结节性硬化症蛋白1/结节性硬化症蛋白2磷酸化，再通过关闭Ras蛋白脑组织同源类似物，抑制雷帕霉素靶蛋白，诱导自噬[23-25]；⑤Bax抑制剂BI-1通过抑制Bax，降低钙离子水平，影响线粒体功能，诱导自噬[26]。

2.2 钙离子抑制自噬

钙离子抑制自噬的途径:①P3R介导的钙离子降低Beclin1从BCL-2上释放，自噬体生成减少，自噬水平降低[27]；②P3R介导的钙离子，活化钙蛋白酶，使自噬相关基因-5(autophagy related gene-5,ATG5)蛋白与ATG12蛋白分离，降低ATG5-ATG12复合体水平，降低自噬[28]；③内质网释放到线粒体的钙离子增多，使三羧酸循环增加，ATP产生增多，进而抑制自噬[29]；④P3R介导钙离子进入线粒体，导致ATP生成增加，AMPK被抑制，从而抑制自噬[29]。

钙离子抑制顺铂诱导肿瘤细胞自噬研究较少。由于自噬具有保护或促死作用，肿瘤细胞最终命运不同。已有研究表明，顺铂诱导宫颈癌海拉细胞发生自噬时，钙离子水平增加，联合钙离子释放抑制剂给药，降低胞浆和线粒体中钙离子水平，从而降低肿瘤细胞自噬，提高肿瘤细胞对顺铂的敏感性，肿瘤细胞生存率下降[30]。可见细胞质内钙离子能增强顺铂诱导的自噬反应，而调控的自噬对于肿瘤来说起保护作用。顺铂诱导卵巢癌SKOV3细胞发生内质网应激和自噬反应，并伴随着细胞质中钙离子浓度上升，络合细胞质中钙离子，增强其下游自噬的反应强度，说明细胞质中的钙离子对自噬具有抑制作用[31]。可见在化疗药物作用下，钙离子对自噬起着重要调节作用，导致肿瘤细胞对化疗药物敏感性改变。由于钙离子与自噬联系复杂，肿瘤细胞种类不同，技术限制或钙离子刺激强弱，刺激时间等原因，钙离子与自噬在顺铂作用肿瘤细胞中具体机制仍需进一步研究。

3 钙离子和凋亡

细胞凋亡是一种高度保守的程序性死亡过程。顺铂是一种有效调节钙离子浓度的化疗药物。钙离子浓度、位置等的改变必然影响肿瘤细胞的命运。近些年越来越多的研究发现，顺铂发挥抗肿瘤作用与交叉对话的细胞器有关，尤其是线粒体和内质网之间，其中典型的信号就是钙离子[32]。

3.1 线粒体中的钙离子和凋亡

生理状况下，线粒体中钙离子活化克雷布斯循环(krebs cycle)中的酶和刺激ATP生成。病理条件下，线粒体会增加线粒体中钙离子的释放，导致线粒体钙超载，PTP开放和凋亡因子释放(如细胞色素C)，诱导肿瘤细胞死亡[33]。

通过研究发现，顺铂作用海拉细胞可以提高内质网和线粒体钙离子浓度，触发线粒体调控和内质网调控的凋亡途径。联合钙离子阻断药，可以降低顺铂的毒性作用。BCl-2家族蛋白是线粒体途径凋亡的关键调节子，包括促凋亡蛋白(BAX、BAK)、抗凋亡蛋白(BCL-2)和BH-only蛋白(Bid、Bim、Bid)。其中BCL-2促凋亡家族的Bax和Bak，也可通过调控内质网的钙离子，致使线粒体钙超载，触发凋亡[34-35]。BcL-2抑制剂ABT737或BcL-2 siRNA提高细胞质和线粒体中顺铂诱导的钙离子水平，增加线粒体介导和内质网介导的凋亡水平[36]。顺铂诱导的内质网应激耐受，可降低内质网应激介导的凋亡水平，减少胞浆中的钙离子转移到线粒体，维持线粒体正常活动，导致顺铂敏感性降低[5]。

3.2 内质网释放的钙离子和凋亡

各种生理和病理情况下，包括缺氧、内质网钙离子耗竭、氧化损伤、高脂饮食、低血糖等均可导致内质网蛋白折叠的能力失衡，导致未折叠蛋白堆积，即内质网应激。细胞通过未折叠蛋白反应、自噬和蛋白酶体等途径进行恢复，若内质网应激过度，则细胞死亡[34]。研究发现，顺铂可以提高细胞质和线粒体中的钙离子水平，触发内质网介导的和线粒体介导的凋亡途径。通过钙离子螯合剂BATA，下调钙蛋白酶、caspas-3、caspas-4和CHOP(促凋亡转录因子)，降低顺铂诱导的凋亡水平[14]。顺铂诱导内质网应激过程中，内质网应激可通过mTOR和Beclin1途径调控自噬，导致肿瘤细胞对顺铂敏感性下降。

3.3 MAM钙离子和凋亡

近些年越来越多的研究发现，顺铂发挥抗肿瘤作用与交叉对话的细胞器有关。尤其是线粒体和内质网之间，而其中典型的信号就是钙离子。研究表明，ABT737或Bcl-2 siRNA增加细胞质和线粒体中顺铂诱导的钙离子水平，提高线粒体介导和内质网介导的凋亡水平。此外，ABT737或BcL-2siRNA通过线粒体相关的内质网膜(mitochondria-associated membranes,MAM)，导致顺铂诱导的内质网-线粒体接触点增加，增加钙离子的转移，致使线粒体钙离子超载，发生凋亡[36]。还有，对顺铂诱导的内质网应激耐受会抑制内质网介导的凋亡，进而缓和线粒体和内质网钙失衡，维持细胞存活，导致顺铂耐受。其中还发现顺铂诱导MAM结构改变，增强线粒体和内质网的联系，导致线粒体钙超载，发生凋亡[5]。在内质网和MAM上的P53，通过与sarco/ER钙离子-ATPase泵联系，调控线粒体和内质网交叉对话，诱导钙离子依赖的凋亡[37]。

顺铂作为一种化疗药物，可以通过多种途径对胞浆、线粒体和内质网的钙离子浓度和位置产生重要影响，既而调控下游分子，参与肿瘤细胞死亡。而钙离子在顺铂耐药细胞株中相较于非耐药细胞株浓度上升变化不明显，则说明钙离子也参与到了肿瘤细胞顺铂耐药机制中，一定程度上降低了顺铂诱导的耐药肿瘤细胞的死亡。综上所述,重要细胞器或胞浆内钙离子浓度的失衡或位置变化对顺铂诱导肿瘤细胞死亡具有重要意义。