口服湿热痹胶囊大鼠体内代谢产物分析

李 鑫，杨 钻，潘韬文，王嘉一，丁 雪，李 坤*

(1.辽宁师范大学化学化工学院，辽宁 大连 116029;2.大连医科大学中西医结合学院，辽宁 大连 116044)

湿热痹胶囊是中国传统中药复方，由苍术、忍冬藤、地龙、连翘、关黄柏、薏苡仁、防风、威灵仙、防己、川牛膝、粉萆薢、桑枝12味药材组成，长期以来一直用于类风湿关节炎的治疗。这些草药都具有强大的抗炎活性[1-12]，并且在中国已经有很好的治疗风湿病和关节炎历史[13]。中药复方是通过众多的化学成分相互协调作用以发挥药效，确定其中化学成分展开全面研究是十分必要的。因此通过超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS)确定湿热痹胶囊中主要化学成分以及湿热痹胶囊在动物体药物原形成分，为寻找其中的活性化学物质提供基础，同时为湿热痹胶囊在中医临床实践中治疗类风湿关性节炎奠定科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料

SPF级SD大鼠，雄性，体重(200±20)g，由大连医科大学实验动物中心提供。实验所使用动物严格按照实验室动物保护指导原则进行，所使用动物征得大连医科大学动物实验伦理委员会同意。

湿热痹胶囊提取膏(本溪国药中成药工程技术研究中心有限公司)，羧甲基纤维素钠(天津市大茂化学试剂厂)，肝素钠(大连美伦生物技术有限公司)，色谱纯甲醇(瑞典Oceanpak公司)，色谱纯乙腈(瑞典Oceanpak公司)，超声清洗器(昆山超声仪器有限公司)，Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)，Agilent 6530 四极杆飞行时间液质联用系统(美国安捷伦科技有限公司)，UGC-12W氮吹仪(北京优晟联合科技有限公司)，大鼠代谢笼(江苏赛昂斯生物科技有限公司)

1.2 给药设计

湿热痹胶囊提取膏成人推荐用法用量：口服，一次4粒，一日3次。根据人和动物间按体表面积折算，换算为大鼠剂量:等剂量比值×(药量/人的体重),其中成人标准体重设置为70 kg。

根据推荐剂量，设定本试验的临床剂量为正常给药的剂量，换算为大鼠给药剂量：湿热痹胶囊提取膏，临床剂量0.71 g/kg。

1.3 实验方法

1.3.1生物样品的收集

将SD大鼠随机分为两组(n=3)，即空白组和给药组。空白组给予等剂量的生理盐水，给药组按0.71 g/kg剂量给大鼠灌胃，所有大鼠分别安置在代谢笼中用于收集尿液和粪便。在给药后12 h，收集每只大鼠的尿液和粪便。尿液和粪便样品保存在-80 ℃。所有大鼠再次分别灌胃给予生理盐水和湿热痹胶囊，并于在给药后5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h眼眶静脉丛取血(约800 μL)于预先涂有1%肝素钠生理盐水的Eppendorf 管中，立即将血液样品以4000 r/min(4 ℃)离心10 min以获得血浆样品。血浆样品保存在-80 ℃。

1.3.2湿热痹胶囊供试品溶液制备

取湿热痹胶囊样品，研细，取0.5 g，精密称定，于50 mL的定容瓶中，加入50 mL色谱纯甲醇，密塞，然后将混合物在超声处理(250 W，频率100 kHz)30 min，然后以13 000 r/min下离心10 min，取上清液，将获得上清液用于UPLC-MS样品分析。

1.3.3生物样品供试品溶液制备

血浆样品供试液的制备：冷冻血浆样品在室温解冻，涡旋30 s，然后将200 μL血浆和600 μL乙腈混合。将这些混合液涡旋3 min，静置5 min，然后以13 000 r/min离心10 min以沉淀蛋白质。取上清液600 μL于1.5 mL Eppendorf管，混合各时间点的上清液，最终用氮气吹干。-80 ℃冻存直至分析。复溶：50 μL甲醇重构并超声处理，然后以13 000 r/min离心10 min，将获得上清液用于UPLC-MS样品分析。将获得上清液用于UPLC-MS样品分析。

尿液样品供试液的制备：冷冻尿液样品在室温解冻，涡旋30 s，然后将500 μL尿液和500 μL乙腈混合。将这些混合液涡旋3 min，静置5 min，然后以13 000 r/min离心10 min以沉淀蛋白质。取上清液800 μL于1.5 mL Eppendorf管，用氮气吹干。-80 ℃冻存直至分析。复溶：100 μL甲醇重构并超声处理，然后以13 000 r/min离心10 min，将获得上清液用于UPLC-MS样品分析。

粪便样品供试液的制备：冷冻的粪便样品在37 ℃干燥，然后粉碎并充分混合。将2 mL甲醇加入0.1 g粪便粉末中。在超声波浴将粪便样品提取30 min，然后13 000 r/min离心10 min，取上清液1200 μL于1.5 mL Eppendorf管，用氮气吹干。-80 ℃冻存直至分析。复溶：200 μL甲醇复溶并超声处理，然后以13 000 r/min离心10 min，将获得上清液用于UPLC-MS样品分析。

1.4 样品检测

1.4.1色谱条件

色谱柱为Waters公司C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，柱温40 ℃。流动相为0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液，流速0.4 mL/min，进样量为10 μL，注射泵方式连续进样。分析条件：采用梯度洗脱，0 min时0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液(95∶5,V/V)，在4 min内升到0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液(80∶20,V/V)，并维持等度洗脱至8 min，于14 min时升到0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液(10∶90,V/V)，并维持等度洗脱至17 min。

1.4.2质谱条件

采用电喷雾电离离子源，正、负离子模式检测：干燥气体(N2)流速10.0 L/min；干燥气体温度350 ℃；鞘气流量12.0 L/min；鞘气温度400 ℃；喷雾器气体压力30 psig(1 psi=6894.76 Pa)；毛细管电压4 kV；碎片电压120 V；锥孔电压65 V；光学相干断层扫描射频750 V；MS/MS实验碰撞电压10/30 eV；一级质谱母离子扫描范围m/z 100～1500，二级离子扫描范围m/z 100～1500。

2 结 果

2.1 血浆中药物成分

血浆成分分析存在着含量低、组分多、分离难、生物个体差异大的特点，质谱法测定入血成分快速、微量、精确。通过UPLC-MS法对湿热痹胶囊组的大鼠血浆样品进行分析，并与空白组比较，发现湿热痹胶囊中有7个化学成分能被吸收进入血液(见表1，图1)。本实验血浆样品中，检测到7种原型入血成分，可能为湿热痹胶囊的药效物质。但由于血浆中化合物浓度较低，混合时间点取样以及对代谢产物的研究有限，未确定是否有新的代谢产物出现。

2.2 尿样中药物成分

SD大鼠灌胃给予湿热痹胶囊后其尿液样品进行检测，并比较给药血样、空白血样、湿热痹胶囊的提取液基峰离子图，共检测发现6个药物成分(原型成分)，其成分见表2，图2。

2.3 粪便中药物成分

SD大鼠灌胃给予湿热痹胶囊后其粪便样品进行检测，并比较给药血样、空白血样、湿热痹胶囊的提取液基峰离子图中，共检测发现11个药物成分(原型成分)，其成分见表3，图3。

3 讨 论

采用UPLC-MS法在湿热痹胶囊分析出114种成分。分析出湿热痹胶囊中7种入血的原型成分；在尿液中分析出湿热痹胶囊原型成分6种；粪便中分析出湿热痹胶囊原型成分11种。推测其可能为湿热痹胶囊发挥药效的物质基础。为进一步探究其作用机制，应进一步对24种原型成分进行抗炎、抗病毒等体外活性测试，期望筛选出具有抗炎、抗病毒的活性单体。

湿热痹胶囊是传统复方中药，在临床中应用较为广泛，祛风除湿、清热消肿、通络定痛。用于湿热痹证，其症状为肌肉或关节红肿热痛，有沉重感，步履艰难,发热,口渴不欲饮，小便黄淡。研究结果表明，UPLC-MS法可以快速、系统地对湿热痹胶囊中化学成分进行定性分析。研究较为全面系统地阐明湿热痹胶囊的化学成分组成、探究其药效物质基础，为湿热痹胶囊的质量控制研究及临床应用提供坚实的理论依据。通过UPLC-MS法分析生物样品(血浆、尿液及粪便)中湿热痹胶囊中原型成分，为寻找其中的活性化学成分提供物质基础，同时为湿热痹胶囊在中医临床实践中治疗类风湿关性节炎提供科学依据。

表1血浆样品中药物成分

NoRT(min)FormulaCompoundMeasured,Mode,Error(ppm)MS2 Fragmentions10.96C4H6O4Succinic acid117.0189[M-H]-(4.02)100.928623.55C17H24O9Syringa vulgaris395.1315[M+Na]+(-0.62)107.9641;184.8831;283.7984;382.268734.39C16H22O9Sweroside403.1271[M+COOH]-(-0.75)154.8969;228.8376;290.6950;332.762745.97C16H18O6Cimifugin307.1176[M+H]+(0.12)118.6173;141.9530;227.0545;298.141456.59C14H12O4Tetrahydroxystilbe-ne(isomer)289.0729[M+COOH]-(-4.7)123.1822;154.9076;186.9998;251.001168.86C19H22O5Imperanene331.1533[M+H]+(-2.03)164.9180;204.8883;252.8219;314.1860713.05C18H30O2α-linolenic acid301.2147[M+Na]+(-4.22)273.1498;225.1413;173.0975;159.1117

表2尿液样品中药物成分

NoRT(min)FormulaCompoundMeasured,Mode,Error(ppm)MS2 Fragmentions12.38C16H24O10Loganic acid399.1261[M+Na]+(0.32)179.0289;203.0538;219.0624;237.070124.36C17H26O10Loganin435.1516[M+COOH]-(-2.04)274.8388;238.9982;217.997535.27C22H24O93-Methoxynobile-tin477.1402[M+COOH]-(0.23)164.9221;268.7968;350.8278;410.736545.44C23H26O11Calceolarioside A477.1383[M-H]-(3.81)154.9031;215.9946;311.0420;393.343655.72C37H40N2O6Fangchinoline609.2963[M+H]+(-0.48)192.1000;367.1628;546.2193;578.2543610.09C27H34O11Arctiin(isomer)552.2437[M+NH4]+(0.39)201.0811;277.1273;384.6462;480.3543579.2075[M+COOH]-(1.49)268.8031;394.7677;464.0126;545.8841

表3粪便样品中药物成分

NoRT(min)FormulaCompoundMeasured,Mode,Error(ppm)MS2 Fragmentions12.341C13H10O2Atractylodinol216.1[M+NH4]+(4.53)136.9224;177.9454;199.943822.408C6H6O35-Hydroxymethylfurfural127.0388[M+H]+(1.32)112.086832.601C16H18O9Chlorogenic acid353.0833[M-H]-(-1.27)179.0366;135.042242.988C26H32O12Phellodendroside554.2209[M+NH4]+(4.21)138.9018;246.7883;342.8087;474.200353.834C20H18O5Moracin H356.1494[M+NH4]+(-0.45)177.0799;192.1017;251.0683;285.107564.033C20H23NO4Isocorydine342.1698[M+H]+(0.59)137.0608;177.0783;192.0989;214.081775.409C21H25NO4Tetrahydropalmatine356.1857[M+H]+(-0.31)170.7499;220.0862;264.0776;291.624286.619C38H42N2O6Menisine(isomer)623.3121[M+H]+(-0.92)174.0901;381.1806;592.266796.636C38H42N2O7Fenfangjine A639.306[M+H]+(0.76)192.0987;318.1532;452.7926;567.29421010.117C19H21NO2Argentinine296.1645[M+H]+(0.18)136.0610;166.0666;194.8710;254.53811111.361C39H62O12Ophiopogonin C'723.4305[M+H]+(1.85)685.4343;556.2338;432.6841;373.1499