第二代测序在肿瘤临床研究中的应用

(山东大学齐鲁医院肿瘤内科，山东 济南 250012)

随着现代医学科学技术的飞速发展，恶性肿瘤的诊治已经进入了生物信息大数据与个体化治疗相结合的精准医疗时代。在这个发展过程中，高通量测序又称下一代测序(the Next Generation Sequencing，NGS)技术以其通量高、信息量大、灵敏度高、耗时短的优势发挥了关键性的作用，逐渐被越来越多的研究者所接受和采用。作为新一代的测序技术，NGS可对数以百万计的不同DNA片段混合物进行深度测序，使得短时间内获知个体或疾病的全部基因组信息成为可能。与基因芯片、单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)分析和传统的Sanger测序相比，高通量测序可以对从样本中得到的DNA和RNA进行更大规模和更高覆盖度的快速测序，从而得到全景式的分析，并能有效检测到发生频率很低的DNA及RNA变化；有效克服了全基因组关联研究(Genome-Wide Association Studies，GWAS) 中假阳性率、假阴性率较高，以及检测到的SNP很少位于功能区，或对致病的稀有变异和结构变异不敏感等的局限性。NGS主要包括全基因组测序(whole-genome sequencing，WGS)、全外显子组测序(whole-exome sequencing，WES)以及目标区域测序(targeted regionsequencing，TRS)等[1]。NGS技术带来的“革命性”的进步不仅为疾病的基因诊断提供了前所未有的“利器”[2-3]，而且特别适合肿瘤这类同遗传基因及个体变异双重相关、具有高度异质性的复杂病种[4]。NGS技术的应用使得肿瘤临床和基础研究面临着历史性的发展机遇[5]。研究者将NGS技术应用到恶性肿瘤多个领域的基础和临床研究中，在肿瘤的发病机制、分子分型、诊治手段及预后分析等方面获得了一系列重大突破。本文拟结合一些典型研究对NGS在肿瘤临床研究中的应用作一综述。

1 发掘肿瘤驱动基因

肿瘤细胞的生成及其恶性生物学表型的维持，有赖于某个或某些癌基因的持续活化，这些癌基因称为肿瘤驱动基因[6]。体细胞基因突变，尤其是驱动基因突变造成的癌基因激活或者抑癌基因失活，在恶性肿瘤的发生发展过程中发挥着至关重要的作用。因此，寻找肿瘤的驱动基因对阐明肿瘤发生发展机制以及发掘可能的药物作用靶点等具有非常重要的意义。NGS的高通量、高灵敏度为其发现未知的基因改变提供了得天独厚的条件，使其成为大规模发现肿瘤驱动基因的“利器”。在美国国立卫生研究院发起的癌症基因组图谱项目(The Cancer Genome Atlas，TCGA)中[7]，研究者对276例可切除结肠癌患者的肿瘤样本进行了全外显子序列、DNA拷贝数、启动子甲基化水平、mRNA和microRNA的表达水平等遗传学指标的测定，发现除了已知的APC、TP53、KRAS等常见的突变外，ARID1A、SOX9、FAM123B/WTX等既往报道极少的突变及ERBB2、IGF2等基因的扩增发生频率也较高。在乳腺癌[8]、头颈部鳞癌[9]、恶性胶质瘤[10]、卵巢癌[11]等肿瘤当中，TCGA协作组通过NGS的方法也发现了一些以前不曾报道过的突变基因。大量新驱动基因的发现，不仅有助于更好地探究肿瘤发生发展的分子机制，也为开发高效、安全、特异的靶向药物提供了宝贵的候选靶点。HODIS等[12]利用NGS的方法，对135例黑色素瘤患者的肿瘤标本及其相邻正常组织进行了全外显子测序。研究人员总共检测到了86 813个编码碱基的突变，平均每百万个碱基对中就有14.4个编码碱基的突变，这比其他肿瘤的突变率都要高。而之后，他们还发现了PPP6C、STK19等6个新的黑色素瘤突变的基因，其中的PPP6C、STK19均可作为药物研发的潜在靶点。

2 揭示肿瘤异质性

寻找共同的驱动基因并开发相应的靶向药物是使恶性肿瘤的药物治疗获得重大突破、从而显著改善患者预后的重要手段。但并不是所有的肿瘤都能找到具有所谓药靶潜质的驱动基因，也不是所有患者都能从针对主要驱动基因的治疗中获益。其主要原因就是肿瘤中广泛存在的异质性。这种异质性使很多寻找肿瘤“主要”驱动基因并进行靶向药物研发的研究遭遇了滑铁卢，也导致了很多患者对靶向治疗药物的原发性耐药。肿瘤异质性可理解为同一种肿瘤表现出不同的遗传背景、病理类型、分化状态、基因变异及蛋白质表达特征。肿瘤异质性包括空间异质性和时间异质性，前者包括个体异质性、同一个体内的瘤间异质性和瘤内异质性；时间异质性是指肿瘤发展的不同阶段存在着不同的遗传学特征。这些差异使肿瘤的生长速度、侵袭能力、对药物的敏感性、预后等各方面产生不同；更导致肿瘤驱动基因谱的不同及相应药靶的选择障碍。肿瘤异质性产生的机制尚不明确，目前认可度较高的学说有：克隆进化学说[13]、肿瘤干细胞学说[14]和肿瘤进化的树干-树枝理论[15]。全面揭示肿瘤的异质性，就要求研究人员必须多点取样，即尽量多地获取某个患者不同部位(通常是原发灶和转移灶)或者不同时点的标本，从而描绘出这个患者的肿瘤发病机制及动态演化的分子图谱。

GERLINGER等[16]采集了一位肾透明细胞癌患者的9处原发灶、1处肾周转移灶、2处胸膜转移灶标本，测定了标本全外显子序列、DNA拷贝数及mRNA的表达水平等。有研究者推测，BCA52、CCR6、VHL等41个存在于所有肿瘤标本中的基因突变可以被视为肿瘤发生早期的起源性突变，而SPATA21、ALKBH8、ERCC5等38个转移灶中共有的突变则可能是出现在转移早期，是驱动转移、定植的关键基因。SESN2、CCBL2、CDKN1B等32个原发灶共有的基因，可能是在肿瘤演化的过程中形成的，可能促进肿瘤适应局部微环境，也可能是无意义的突变。基于以上分析，靶向药物的研发应该针对那些存在于所有癌细胞，即在肿瘤演化早期出现的基因，而不只是那些存在于部分癌细胞的基因。

ELZA等[17]也在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)中进行了类似的研究。他们收集了7例NSCLC患者的25份不同部位(原发灶和肺内转移淋巴结)的标本，进行全基因组测序或全外显子测序。研究者把所有的基因突变或缺失按不同的标本中出现的频率分为三类：第一类，出现在所有样本中，包括广为人知的EGFR、TP53、BRAF、ALK、AKT、PTEN等研究较多的基因；第二类，出现在一处但不是所有的样本中；第三类，仅出现在一处样本中。开发针对第一类基因的靶向药物有利于更大范围地杀灭肿瘤细胞亚群，减少肿瘤原发耐药。在其中一例患者的标本中，两处标本的病理类型表现为腺癌，另外两处标本的类型则趋向于鳞癌。而这两种不同类型的标本的基因突变图谱则完全不同。由此可以推测这两个亚群的癌细胞的肿瘤生物学行为有着极大的差异。因此，针对这例患者单一位点的穿刺活检极有可能造成误诊，而单一的药物治疗很可能不能覆盖所有的癌细胞。瘤内异质性可以导致穿刺活检的误诊，以及耐药的发生。基于瘤内异质性研究的靶向药物研发，则有望针对更大范围的癌细胞亚群，延长耐药出现的时间甚至避免出现耐药。

3 揭示肿瘤分子分型

NGS技术的发展给很多肿瘤的分子病理分型带来了突破性的进展。以胃癌为例，半个世纪以来，胃癌的病理分型与其发病机制研究一样进展缓慢。1965年的Lauren分型[18](肠型、弥漫型)因其简单、实用仍在临床沿用，但其不涉及分子机制。2006年有学者发现不同的Lauren分型对化疗的反应不同可能源于不同的病理分子机制，迈出了胃癌分子分型可贵的一步[19]。2011年，新加坡学者基于基因芯片技术，将胃癌按照基因组的特征分为基因组肠型(Genomic intestinal, G-INT)和基因组弥漫型(Genomic diffuse, G-DIF)；G-INT患者的预后明显好于G-DIF的患者；且以5-FU为基础的辅助化疗在G-INT患者中疗效更好；提示这种内在分型可能是胃癌预后的独立预测因子[20]。2013年，他们在此基础上又将胃癌分为了间质型(mesenchymal)、增殖型(proliferative)和代谢型(metabolic)。增殖型胃癌细胞存在高度的基因组不稳定性、P53突变和DNA低甲基化；代谢型对5-FU敏感，是否接受5-FU辅助治疗显著影响患者生存；而间充质型具有肿瘤干细胞的特性，高表达CD44，对PI3K/Akt/mTOR靶点抑制剂敏感[21]。这些研究拓展了胃癌的分子分型及其疗效预测的研究空间，为后续的重要研究奠定了基础。2014年《Nature》在线发表的TCGA分型[22]堪称NGS技术应用于胃癌分子机制研究的里程碑，引起广泛关注。研究者将胃癌患者组织和血液标本进行了6大分子平台的测序分析，包括：成组体细胞拷贝数分析、全外显子测序、成组DNA甲基化分析、mRNA测序、miRNA测序及成组反相蛋白分析。基于对所得数据的分析及整合，提出了一种全新的胃癌分子分型(EB病毒阳性型、微卫星不稳定型、基因组稳定型、染色体不稳定型)及其遗传学特征及干预对策。2015年，亚洲癌症研究协作组发表了基于亚洲患者标本的ACRG的分型，基于多项NGS结果将患者的遗传特征进行分类并分析了其与预后的关系[23]。研究者根据病理标本中微卫星不稳定性(MSI)、上皮-间质转化(EMT)以及TP53突变的情况将胃癌分为微卫星稳定(MSS)/EMT、MSI、MSS/TP53+和MSS/TP53-四种亚型。研究发现MSI亚型的预后最好，其主要特点是：高突变(ARIDIA、KRAS、PI3K-PTEN-mTOR、ALK)，低复发率，MLH1缺失，DNA甲基化，多为肠型，复发率22%；其次是MSS/TP53+，预后较好，EBV的感染较多，高突变(APC、ARID-1A、KRAS、PIK3CA、SMAD4)；而MSS/TP53-预后较差，多合并TP53突变；MSS/EMT则多为弥漫型，多为印戒细胞癌，CDH1表达缺失，突变率低，早期发病，复发率高，预后最差。此外，MSS/EMT亚型中的腹膜种植率高于其他三种之和。MSI型和MSS/TP53-型的肝转移率均高于MSS/EMT型和MSS/TP53+型。

肺大细胞神经内分泌癌(Pulmonary large cell neuroendocrine carcinoma，LCNEC)是一种异质性很强肿瘤，它和小细胞肺癌(small-cell lung cancer，SCLC)及NSCLC之间的生物学关系仍不明确。而这种不确定性导致临床上很难给出最佳的治疗方案[24]。有学者利用全外显子测序的方法，分析了45例患者的肿瘤标本及其匹配的正常组织标本，并将LCNEC的基因组改变与其他类型的肺肿瘤进行了对比。研究者发现根据基因组的不同改变，可以将患者分为3个亚组：SCLC样：这组患者均有TP53和RB1的基因突变或缺失，并且有一些其他的常见于SCLC的基因改变，包括MYC扩增等；NSCLC样：这组患者缺乏TP53和RB1的共同改变，并且存在广泛的NSCLC样的基因突变，例如STK11、KRAS、KEAP1突变等；良性肿瘤样：这组患者有MEN1突变，肿瘤突变负荷较低。SCLC样亚组和NSCLC样亚组的许多临床病理学特征都存在显著差别，如SCLC样亚组的肿瘤增殖活性更高(Ki67表达更高)，而NSCLC样亚组表达腺癌分化标志物的水平却更高。另外，对于以铂类为基础的化疗，SCLC样亚组的敏感性明显高于其他两个亚组[25]。这项研究为应用NGS手段揭示肿瘤的分子分型并指导临床治疗提供了新的思路。

4 为罕见突变提供治疗方案

近年来，晚期恶性肿瘤的靶向治疗发展得如火如荼，尤其是以几代EGFR的小分子酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors，TKI)在EGFR突变晚期NSCLC中的持续研究和应用为突出的代表。诚然，基于Sanger测序的结果分析也可以用于指导临床对于相应患者的选择。但是NGS技术有着同时检测多个基因、灵敏度更高、能够发现未知或罕见突变等优势，对于发现罕见突变的患者具有不可替代的作用。以NSCLC的EGFR突变为例，其不常见的突变类型包括19号外显子插入突变(约占1%)，20号外显子插入突变(约占4%)，20号外显子S768I突变(约占1%)，18号外显子G719X点突变(约占3%)以及21号外显子L861Q突变(约占2%)等。在HE等[26]的研究中，EGFR 19外显子插入突变的患者对吉非替尼和阿法替尼敏感。一项回顾性研究发现，阿法替尼对于某些类型的EGFR基因罕见突变疗效较好，存在EGFR基因G719X、L861Q和S768I突变的患者获益较好，但是阿法替尼在其他突变类型中活性均较低[27]。最近报道，临床医生通过NGS技术鉴定了一例NSCLC患者的EGFR的G719C、S7618I罕见突变以及KRAS的E49K突变，并据此选择阿法替尼作为治疗药物。后续随访发现服用阿法替尼11个月后，患者血清CEA明显降低，胸椎转移灶明显缩小[28]。除此之外，BRAF基因突变、ALK基因重排、ROS-1基因融合以及其他未知的或者罕见的突变，都可以通过NGS进行鉴定，这对于第一代测序来讲，无论是标本量、耗时长度还是发现未知突变来讲，都是不可能完成的任务。

5 预测疗效、跟踪复发、判断预后及分析耐药机制

SCLC是一种侵袭性很高、易转移的疾病，目前的治疗手段仍然是以全身化疗为主。很多患者往往是初治敏感，但是不久之后出现耐药。通常把初治3个月内出现的耐药称之为原发耐药。CARTER等[29]对SCLC患者血标本中的循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTC)进行第二代测序，利用拷贝数变化(Copy-number aberrations，CNA)建立了一个预测化疗疗效的模型。这个模型预测化疗敏感或者耐药的准确率达到了83.3%，并且根据模型预测之后，化疗敏感组和耐药组患者的无进展生存期(progression-free survival，PFS)，总生存期(overall survival，OS)均有显著差异。利用这个模型，只需利用NGS技术检测病人CTC的CNA，就可以提前判断患者对化疗的敏感性，这是其他技术手段做不到的。

近些年来，对循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)的研究以及应用的报道越来越多。ctDNA是肿瘤患者血液中肿瘤来源的游离DNA，能全面反映患者体内的基因变化情况，具有无创、可重复、患者依从性高的特点，而且能通过多次采样及时有效地捕捉治疗过程中肿瘤基因组变化情况，实现对病情发展以及治疗反应动态实时监测[30-31]；而且能部分克服肿瘤异质性这个棘手的问题。虽然CTC也具备上述优势，但ctDNA在检测肿瘤基因组改变等方面有着更高的灵敏度和特异度[32]。

GARCIA-MURILLAS等[33]开展的一项针对早期乳腺癌的临床研究显示，相较于现有检查手段，基于NGS技术的ctDNA的突变监测可以将术后复发的诊断时间平均提前约7.9个月。这有助于及时发现微小残留病灶并及时采取相应的辅助治疗措施。ctDNA也可以用于反映患者对手术或者化疗的响应[34]、检测靶基因耐药突变[31]等方面。

EGFR敏感突变的NSCLC患者在临床使用EGFR-TKI治疗9～14个月后会出现耐药，耐药机制中最常见的是获得性T790M突变、MET扩增等一系列的变化。对于耐药机制的分析也是NGS擅长的领域。同样，对于T790M突变的特效药物奥希替尼(Osimertinib)来讲，也会面临继发耐药的问题。有学者利用NGS技术对7例奥西替尼耐药患者的ctDNA进行高通量测序，发现了C797S突变；后续实验证实C797S突变确实可以导致奥西替尼出现耐药[35]。 PLANCHARD等[36]利用NGS技术，对2例奥西替尼耐药患者的活检标本进行了全外显子测序，发现HER2或MET扩增可能是耐药机制之一。奥西替尼与高选择性小分子 MET 抑制剂Savolitinib联合治疗有望延缓甚至克服耐药的发生，为这部分患者人群赢得更高的生存获益。因此，NGS技术为跟踪分析耐药机制、发现新的治疗靶点，从而促进恶性疾病向“慢性”疾病转化，以及实现晚期恶性肿瘤患者长期存活的目标提供了有力的技术手段。

6 为免疫治疗筛选适合患者

近年来，免疫治疗如火如荼，针对PD-1/PD-L1及CTLA4等免疫检定点的抑制剂在许多肿瘤的治疗领域获得了空前的成功。但是免疫治疗尚存在很多争议，其中之一就是如何筛选获益的人群。目前通常把PD-L1存在的表达作为生物标志物之一[37]。但这一标志物并不完美，在很多研究中并未能筛选出免疫治疗的优势人群[37]。肿瘤突变负荷(Tumor Mutation Burden，TMB)是一项逐渐受到重视的免疫治疗预测指标，TMB越多，意味着肿瘤新生抗原越多，就越有利于免疫系统识别肿瘤细胞，进而发挥杀灭肿瘤的作用[38]。在实际的临床试验中，已经发现有着更高的突变负荷的患者在接受治疗后有着更高的客观缓解率(Objective Response Rate，ORR)以及更长的PFS[39]。错配修复缺陷(deficient Mismatch Repair，dMMR)及高度微卫星不稳定性(Microsatellite instability-high， MSI-H)同样有望作为免疫治疗的重要分子标志物之一。dMMR/MSI-H可以导致产生许多体细胞突变，进而产生许多肿瘤新生抗原，诱导肿瘤微环境局部更多CD8+T细胞的浸润，进而发挥更强的杀灭肿瘤细胞的作用。在一项pembrolizumab的Ⅱ期临床研究中，研究者把患者分为MMR deficient和MMR proficient两组。前者的ORR(40%)以及无病的生存率(PFS Rate，78%)均明显高于后者(ORR为0，而PFS Rate为11%)[40]。因此，dMMR/MSI-H也是免疫治疗预测疗效的分子标志物之一。显然，不管是TMB，还是MMR，都需要通过NGS(通常是全外显子测序)的技术来实现。

7 总结

NGS技术极大地拓展了肿瘤基础和临床研究的思路和方法，在肿瘤学的研究中扮演着越来越重要的角色。一方面，NGS将肿瘤发生、发展的分子机制的基础研究推向深入，在发掘驱动基因、明确分子分型、揭示肿瘤异质性等方面突飞猛进；另一方面，又被越来越广泛地应用于发现罕见突变、预测疗效、判断预后、跟踪复发、分析耐药机制及筛选免疫治疗的优势人群等临床治疗领域。NGS技术在肿瘤基础与临床领域的深入应用和有机结合，及其衍生出来的“同病异治”(雨伞研究)和“异病同治”(篮子研究)的理论与实践，突破了传统研究的范畴，构成了转化医学研究的经典范例，必将极大推动以基因大数据与个体化医疗为特征的现代肿瘤精准医学的发展，为肿瘤患者的生存获益带来质的飞跃。

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