循环肿瘤DNA在结直肠癌临床诊疗中的应用价值研究

杨燕峰，潘琴，王纯

溧阳市人民医院肿瘤内科，江苏常州 213300

近期国内相关研究表明，结直肠癌发病率在我国居所有恶性肿瘤的第三位，且呈逐年上升态势；该病致死率高，早期结直肠癌（Ⅰ、Ⅱ期）患者接受治疗，5年存活率为75%～90%，而晚期（Ⅲ、Ⅳ期）患者的5年生存率仅为40%～55%，因此早期发现、早期治疗对于改善结直肠癌患者预后具有显著积极意义。但CRC并无典型早期症状，多数早期患者仅表现为局部隐痛或大便形状改变等，至症状较为明显时，多已进展至中晚期。既往临床多从活检组织标本中获得肿瘤特异的生物信息，但活检标本系由倾入性操作获得；而有些学者通过唾液、尿液等代谢物进行筛查的结果显示其敏感性、特异性较差。ctDNA是由肿瘤细胞释放的DNA片段，可于外周循环中直接检测，为CRC的早期诊断提供了可能，基于此，该研究对ctDNA在结直肠癌临床诊疗中的应用价值进行探讨分析，综述如下。

1 生物学特性

ctDNA的来源与释放机制目前医疗界尚未达成共识，多数学者认为其是由实体肿瘤细胞破裂或凋亡而释放出的游离基因片段，大小约为0.18～21kb，来源包括循环肿瘤细胞（CTC）、肿瘤原发灶及转移灶，其中凋亡是主要释放机制，同时也包括分泌、坏死等方式；但释放水平及速率尚不明确。研究表明[1-2]，ctDNA具有如下生物学特征：①ctDNA来源于肿瘤原发灶、转移灶，甚至残留微小病灶等机体所有荷瘤部位，因而能够对肿瘤整体特征进行全面反应；②不同类型癌症患者ctDNA含量基线水平波动较大，同一癌症患者个体间差异也较为明显，且其含量水平随恶化程度及“肿瘤负荷”实时变化，因此较高的ctDNA水平常代表癌症已进展至晚期或较差的预后；③ctDNA半衰期较短，在血液循环中的半衰期＜2 h，因而血中浓度是对机体肿瘤状态的实时反映；④因肿瘤细胞有克隆性质，因此ctDNA携带有特异性的遗传信息，其核酸序列与肿瘤特异性核酸序列高度一致，分析ctDNA的基因变异类型与数量，有助于确定对该变异类型敏感的靶向药物[3]。

2 ctDNA的检测

2.1 样本制备

采集血浆、血清均可检测ctDNA，但血清中虽然有较多数量及较高纯度的DNA，同时其也具有易降解的特征。因而，异常基因检测的阳性率不够理想，且若血液凝固后，血细胞将逐步裂解，向血清中释放正常DNA，影响检测结果的准确性。因此，采用血浆检测ctDNA是目前临床最佳取样方法，血浆处理的过程中，应注意将血液置于含有EDTA的抗凝血剂中，离心处理后使用专用试剂盒提取。为提高检测的准确性，检测样本的采集与提取中的具体事项如下：采新鲜外周血后应及时放入含细胞防腐剂和ECTA-K3抗凝血剂的ctDNA BCT试管中；轻柔倒转试管8～10次以保证成分的充分混合；4～37℃下常温运输、保存，无需冷冻储藏。

2.2 检测方法

定性和定量是目前结直肠癌患者ctDNA检测的两种方向，其目的分别在于确定肿瘤的存在及恶性程度，以二代测序（NGS）为基础检测、以聚合酶链式反应（PCR）为基础扩增是目前常用的两大平台检测技术，其中前者多用于批量基因、外显子及基因组的ctDNA检测，具有较高的效率；后者则多用于检测某一特定基因或数个基因的ctDNA，在保证特异性的同时具有较好的敏感性。

3 ctDNA在治疗中的应用

3.1 早期诊断

Tie等[4]研究表明，ctDNA水平检测在早期筛查、早期诊断中具有重要价值，其研究结果显示健康人的血清DNA、CEA水平均显著低于结肠癌患者，提示联合检测能够作为早期筛查指标且特异性较高；有学者在100例健康者与229例行化疗的转移性结直肠癌患者的对比研究中发现后者的ctDNA水平明显较高[5]。但对于早期患者而言，血液ctDNA水平检测目前仍属于探索阶段，仅可作为某些热点突变的初筛或肿瘤组织检测的补充，但较高的特异性和能够避免组织活检所造成创伤的优点显示了其良好的应用前景。

3.2 判断疗效

随着近年来结直肠癌治疗研究的不断进展，抗肿瘤药物呈多样化态势不断出现，因而如何及时评定治疗效果以指导临床已成为目前肿瘤治疗的挑战之一。既往研究证实，结直肠癌患者ctDNA浓度及变异特征能够如实、高效反映肿瘤变化情况，且在评估如肿瘤是否完全切除、某药物对患者的治疗效果方面具有一定价值。闫巍[6]等研究结果显示，手术切除肿瘤3d后结直肠癌患者的ctDNA水平较术前有一过性升高，术后14～30 d的水平则较术前显著下降；同时有研究证实结直肠癌患者术后ctDNA呈明显的下降趋势，而于病情复发患者中则可见ctDNA水平的升高。以上研究均提示ctDNA水平及变化情况能够体现肿瘤进展状况，同时特异性ctDNA的变化与肿瘤负荷存在关联性。

3.3 指导靶向用药

表皮生长因子受体（EGFR）、血管内皮生长因子（VGEF）靶点的单克隆抗体药物是目前已获得临床使用批准的两类结直肠癌靶向药物，其中前者以帕尼单抗、西妥昔单抗为代表，后者以贝伐珠单抗为代表，尽管在2017年的NCCN指南[7]中已不再推荐可切除肺或肝转移瘤的结肠癌患者在新辅助化疗中应用靶向药物，但对需联合用药及复发转移化疗无效的患者，靶向治疗仍为一线或者二线用药。研究表明[8]，KRAS野生型结直肠癌患者采用抗EGFR单克隆抗体可获得显著的生存获益，但存在KRAS基因突变或NRAS突变的结直肠癌患者并不能从使用抗EGFR药物中获益；因此在靶向药物治疗前，需对NRAS和KRAS进行检测，而如使用石蜡包埋的组织这一最为准确的突变检测方法，需一黄豆大小体积的组织，但对于已发生术前远处转移、术后复发远处转移无法手术的患者而言，组织获取较为困难，同时可引起穿孔等严重并发症[9]。ctDNA则在组织获取方面具有显著优势，仅需采集10 mL的外周血即可完成基因测序，患者易于接受，且可重复获取。研究表明[10-11]，不同肿瘤部位、原发肿瘤和转移灶或同一肿块不同部位的肿瘤细胞基因突变情况具有一定差异性，这种差异性将致使组织标本基因检测结果的局限性，无法全面反映整体肿瘤细胞的突变情况，从而对靶向治疗效果产生一定影响；而ctDNA可由全身肿瘤细胞坏死凋亡后释放至血液循环，因此，具有很强地全身肿瘤细胞突变的代表性，因而能够克服肿瘤的异质性，更好的指导靶向用药。

3.4 评估预后

大部分结直肠癌患者治疗后，其机体内多数肿瘤细胞由免疫系统吞噬，但仍有新肿瘤灶出现的可能，常规影像学方法仅可满足评价未行手术切除患者的放疗、化疗或靶向治疗的效果，但因体积的限制，该方法不适用于对于肿瘤复发转移的监测。ctDNA最早应用于乳腺癌及肺癌的预后监测，其变化情况与肿瘤发展具有高度一致性；ctDNA较短半衰期的特性使其能够与实时反映肿瘤变化情况，加之其来源主要为肿瘤细胞，特异性也较高。Diehl等[12]研究结果显示，对结肠癌术后患者进行连续ctDNA突变情况检测能够很好的监测肿瘤复发，其特异度、灵敏度均接近100%。因此，随着术后监测随访时间的延长以及ctDNA研究的日趋深入，可以预见将有更多更具说服力的研究证实ctDNA在评估结直肠癌患者预后及复发中的应用价值。

4 小结

目前ctDNA的检测和分析方法尚无标准，每种方法的指标、适用人群及癌症类型均不尽相同，但ctDNA作为新型肿瘤标志物，具有显著的微创、操作简单、可重复获取、实时、准确等优点，能够较好的克服肿瘤异质性，已显示了其在结直肠癌临床应用中的广泛前景。可以预见，如能克服研究样本量不足、标本无法长期保存等技术问题，在此基础上充分结合影像学检查、常规肿瘤标志物与液体活检技术，结直肠癌患者的诊疗将会更加个体化、精准化，从而显著提高生活获益，改善预后。