Notch信号转导通路在前列腺癌中的研究进展

颜 广，李 霞，邹 练

(1.苏州大学医学部，江苏苏州 215123；2.中国人民解放军火箭军总医院泌尿外科，北京 100088；3.第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西西安 710032)

Notch信号转导通路是100年前 DEXTER[1]在黑腹果蝇的研究中发现，它在生命进化过程中高度保守，参与细胞命运决定、组织分化、器官形成和肿瘤发生进展等重要生命活动[2-4]。在哺乳动物中，Notch通路由4个Notch受体(Notch1-4)、5个配体(DLL1、DLL 3、DLL 4、Jagged1、Jagged12)以及下游的调控靶基因组成。Notch受体是单次跨膜的1型跨膜蛋白，主要由N端的胞外结构(N-terminal extracellular，NEC)和C端的跨膜区(transmembrane，TM)以及胞内区(intracellular domain of the Notch receptor，ICN/NICD)构成[3]。其中NEC主要由29～36个串联的表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)序列和3个富含半胱氨酸的Lin Notch重复序列(Lin Notch repeats，LNR)构成，NEC的主要功能是识别并结合Notch配体，启动Notch信号。不同的Notch受体含有的EGF重复序列不同，Notch1、2都具有36个EGF重复序列，而Notch3和Notch4分别具有34和29个EGF重复序列，这一差别有利于它们识别不同的配体[2]。ICN是Notch受体的主要功能结构域，经典的Notch信号通路活化过程需要经过3步裂解，第1步在高尔基内furin样转化酶(furin-like convertase)的作用下发生S1位裂解，形成胞外段和跨膜段；第2步在金属蛋白酶(metal loprotease，ML)/肿瘤坏死因子-a转换酶(tumor necrosis factor -a converting enzyme，TACE)作用下NTM发生S2位裂解，形成N端和C端两个片段；第3步在早老素-γ分泌酶复合物(presenilin-γ-secretase complex)作用下发生S3位裂解，释放Notch蛋白的活化形式ICN/NICD[2-4]。

NICD转位入核，与非活化的CBF1-Su(H)-LAG1 (CSL) (RBP-Jκ)转录抑制复合物结合，同时募集转录激活蛋白(mastermind-like 1，MAML1)，形成转录激活复合物，进一步调控下游靶基因(如，HES和HEY家族)的表达[5]，从而调控细胞命运决定、分化、增殖、凋亡、组织器官发育及代谢稳态等多个生命过程。

1 Notch信号转导通路对肿瘤的调控作用

Notch信号通路的4个受体在胚胎到成体组织都有着广泛并重叠的表达，但在造血干细胞传代、T细胞和B细胞命运决定和谱系发育、肾前体细胞和血管发生等过程却有着各自不同的功能[3，6]。在肿瘤细胞增殖、凋亡、粘附、上皮-间充质转化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)、迁徙和血管生成等肿瘤发生进展过程起着关键的调控作用[2-3，7-8]。根据Notch信号分子表达水平差异，Notch信号通路可发挥原癌基因或抑癌基因的功能，对细胞存活或死亡、增殖或休眠、分化成终末细胞或转化成肿瘤干细胞等多个细胞生命过程发挥双重调控作用[3，7，9]。Notch通路任意一个信号分子的异常突变失活或激活、过表达、翻译后修饰异常和表观调控异常都会发生Notch信号通路的调控紊乱。根据Notch信号通路的组织功能特点，Notch信号一般在造血干细胞肿瘤和腺癌中起激活作用，而在鳞癌中起抑制作用[2-3，9]。

Notch信号分子的原癌基因作用已有大量报道，在多种造血系肿瘤和实体瘤中发现Notch信号通路的异常激活。最早在急性T淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL)中发现异常激活的Notch1突变体，进一步在黑色素瘤、前列腺癌和乳腺癌中也发现Notch信号分子的促癌功能[3]。Notch信号通过多种分子机制和多条信号通路调控肿瘤的恶性行为。研究表明，Notch信号可抑制促凋亡分子Nur7、P53等的表达，上调抗凋亡分子IAP、Bcl-2和FLIP，从而抑制细胞凋亡；Notch信号通过增强CDK2、cyclin D1和HES1的活性，促进细胞增殖；Notch还可激活PI3K-AKT、ERK、NF-κB，抑制JNK和TGFβ信号通路，发挥癌基因功能，此外，在实体瘤中Notch信号可促进上皮-间充质转化[2-3]。

Notch信号的肿瘤抑制功能的研究相对较少，主要见于皮肤癌等鳞癌[10]，近来在粒细胞性白血病[11]和膀胱癌[12]中也发现其肿瘤抑制功能。在Notch1基因敲除小鼠的基底细胞中发现Wnt和Hedgehog信号表达上调，推测Notch信号抑制细胞增殖和诱导细胞周期停滞可能与Wnt-β-catenin的抑制有关。在特定细胞中，Notch可通过上调其靶基因p21诱导细胞周期停滞。Notch在肿瘤中的作用及调控机制极其复杂，与不同组织细胞所含的特异性靶基因以及不同微环境所含的细胞因子和生长因子不同有关[2]。

2 Notch信号转导通路对前列腺发育和稳态的调控

前列腺是由胚胎时期的尿生殖窦(urogenital sinus，UGS)发育而来，成熟的前列腺结构主要由基底细胞层和腔细胞层包绕形成的腔隙样复合体，其中散在分布在基底细胞中的神经内分泌细胞可分泌神经肽和生长因子。Notch信号通路的受体、配体以及下游的靶基因在前列腺组织中都有着广泛的表达，说明Notch信号通路在维持前列腺发育和稳态中发挥重要作用[13]。通过对鼠科前列腺发育模型研究发现，抑制Notch信号通路可阻止UGS细胞向基底细胞和腔细胞分化，同时对前列腺的平滑肌层也产生破坏[14]。在鼠科成熟的前列腺组织中，Notch1表达阳性的细胞在其组织更新和再生过程中起必要作用，Wnt信号通路可通过下调Notch信号的表达诱导前列腺基底细胞的增殖[15]。相反的，如果过表达Notch1可诱发良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia，BPH)[16]。Notch信号下游的功能基因与TGFβ信号构成了一个调控环，对于维持前列腺上皮干细胞的休眠状态发挥重要作用，Notch信号激活后可抑制基底细胞的增殖，促进腔细胞的分化[17]。Notch还可通过激活NF-κB通路，抑制腔细胞的失巢凋亡[18]。总之，Notch信号转导通路在前列腺上皮细胞的命运决定、增殖、分化和凋亡过程中都发挥重要功能，Notch信号分子的正常表达对于于维持前列腺的正常发育和组织稳态至关重要[13-14]。

3 Notch信号转导通路在前列腺癌中的作用及调控

Notch信号通路的异常与前列腺癌的发生和进展的关系极为密切，无论是前列腺癌临床资料的分析，还是人类前列腺癌细胞系和前列腺癌小鼠模型的基础研究，都发现Notch信号通路对前列腺癌的调控具有多功能性和复杂性，Notch通路信号分子在前列腺癌中同时具有原癌基因和抑癌基因的功能[13，19]。

3.1 Notch信号分子在人前列腺癌样本中的表达分析 大量临床资料表明，Notch信号分子在前列腺癌发生和进展中都存在异常表达，但目前尚未在前列腺癌中发现Notch信号分子突变。早在2002年，LATULIPPE等[20]研究者就发现Notch配体Jag1在前列腺癌转移期和初发期的mRNA表达水平存在差异。后来更多临床样本的研究进一步证实，转移和复发的前列腺癌中Jag1的表达水平明显高于正常前列腺组织和初发前列腺癌[21]。受体Notch1在高级别的前列腺癌和转移性前列腺癌中的表达也明显高于低级别的前列腺癌[22]。Notch3的表达水平与前列腺癌患者的生存率呈负相关[23]。这些研究表明Notch信号在肿瘤的进展中发挥原癌基因的功能。

与上述研究结论相反，亦有报道相对于正常组织和癌旁组织，Notch1和Hey1在前列腺癌中表现为表达水平下调[24]，提示Notch信号通路可能发挥抑癌基因的功能。关于Notch信号通路在前列腺癌中争议，可能与前列腺癌是一个多基因、多条信号通路成因的疾病有关，例如Ets融合蛋白的形成，肿瘤抑制基因PTEN和P53的功能丧失，AR信号通路异常和PI3K-Akt信号通路的异常，都被认为是前列腺癌发生或进展的独立或联合致病原因[25]。

3.2 Notch信号转导通路对前列腺癌细胞系的功能调控 Notch信号分子在前列腺基底样上皮细胞系PrEC以及其他的上皮细胞系(BPH-1、PNT2 和 RWPE)中都有表达，说明Notch信号在维持正常前列腺细胞功能发挥重要作用。与此同时，Notch信号分子在所有的前列腺癌细胞系(如：LNCaP、VCaP、CWR22Rv1、C4-2B、DU145和 PC3)中都有表达，并且与正常前列腺癌细胞系的表达存在很大差异，不同的Notch信号分子在不同的前列腺癌细胞系之间的表达也不相同[13，19]。例如：Notch1在所有前列腺癌细胞系中都表达，但Notch2、Notch3、Notch4和Jag1 仅在LNCaP、C4-2B、DU145和 PC3中表达，Jag1在PC3中的表达远远高于DU145细胞系[13]。Notch信号通路在正常前列腺细胞系与前列腺癌细胞系之间，以及在各种前列腺癌细胞系之间的表达差异，说明Notch在前列腺癌的肿瘤发生中发挥重要作用。

研究揭示Notch信号通路的异常激活具有促进前列腺癌细胞增殖、抑制凋亡和促进浸润、转移的功能[13，19]。在前列腺癌细胞系PC3、DU145、LNCaP和C4-2B中，下调Jag1和Notch1的表达，都表现为细胞生长抑制[26]。在PC3细胞系中，敲低Notch1或下调Rbp-J都会导致其细胞增殖能力下降[27]，过表达Dll4可增加细胞的增殖能力[28]。Notch信号在促进增殖的同时抑制凋亡和失巢凋亡的发生。但Notch信号通路影响前列腺癌细胞的增殖和凋亡的机制极其复杂，有报道Notch1信号敲低后，Akt和FoxM1的表达减少，从而抑制增殖、诱导凋亡[29]；Notch1还可调控Bcl-2和Bax影响前列腺癌细胞的增殖和凋亡[27]；最新研究揭示Notch靶基因Hes-1可通过加强PI3K-Akt信号通路的表达促进腔细胞增殖，同时通过激活NF-κB通路，抑制腔细胞的失巢凋亡，并破坏其分泌功能[18]。Notch信号激活在促进前列腺癌细胞迁徙和浸润方面作用也很显著，在PC3和CWR22RV1细胞系中抑制Notch1，可导致uPA和MMP9的表达下调，进一步降低肿瘤细胞的迁徙能力[30]。Notch1在多西他赛和激素抵抗性前列腺癌细胞系中，Notch和Hedgehog的信号显著增强，说明Notch信号的激活与前列腺癌的进展有关，联合Notch抑制剂(DBZ)和Hedgehog抑制剂处理DU145 和CWR22Rv1细胞系，可通过间接抑制Akt和Bcl-2的表达来消除多西他赛抵抗[31]。

但也有研究报道Notch信号在前列腺癌中发挥抑癌基因的功能，在DU145、PC3和LNCaP中持续激活Notch1功能片段ICN，发现细胞的增殖能力受到抑制[32]。PTOV1可通过下调Notch信号的靶基因Hes1和Hey1，促进PC3细胞的浸润和非贴壁生长[33]。Notch下游的靶基因Hey1/2和HeyL还可作为雄激素受体的共抑制因子，发挥肿瘤抑制的功能[34-35]。前列腺癌细胞在经历神经内分泌分化后，侵袭性明显增强，但在低氧诱导的LNCaP神经内分泌细胞模型中的研究发现，Notch信号的激活有抑制神经内分泌分化的功能[36]。Notch信号通路在前列腺癌细胞系的不同作用，与Notch信号分子的表达剂量和细胞的培养环境有着极为密切的关系，通过在MCF-10A细胞中的研究发现，Notch信号低水平激活可以促进增殖，但是高水平激活反而抑制生长[37]。培养基中钙离子的水平对Notch信号的活性影响很大，在高钙水平下，细胞可以在不需要临近细胞提供配体的情况下，自发的发生Notch受体的裂解，形成活性结构NICD，激活下游信号通路[38]。

3.3 Notch信号通路在前列腺癌动物模型中的研究 在TRAMP、CR2-TAg、Hi-Myc、Pten-null等前列腺癌基因工程小鼠模型中，都存在Notch信号通路的表达异常[13]。TRAMP小鼠前列腺上皮高度表达Notch1，虽然在上皮细胞中没有检测到Jag1，但在内皮细胞中有表达，说明Notch信号在前列腺癌进展中发挥重要功能，肿瘤细胞和基质细胞之间存在Notch信号的交流[32]。LADY小鼠在6周时，Notch信号的表达有显著的提高，说明在肿瘤发生的早期阶段，Notch信号是激活的状态[39]。CR2-Ag小鼠模型中，Hes6和Dll1的表达随肿瘤进展，表达增加，说明与神经内分泌细胞群的增加有关[40]。已有的Notch信号在前列腺癌模型中的研究，尚不能明确阐述Notch在前列腺癌发生进展中的具体机制，随着CRISPR-Cas9等新型基因工程技术的开展，将会有更多更合适的前列腺癌小鼠模型用于Notch信号作用机制研究。

4 Notch信号转导通路与AR、PI3K-Akt信号通路在前列腺癌中的调控关系

研究发现Notch下游的靶基因Hey1可作为AR的共抑制因子，Hey1可以与AR信号转录激活因子SRC1和AR结合，抑制AR基因及AR依赖基因的表达[35]。Hey家族的另外一个成员HeyL也能与AR的功能区域结合，抑制AR的激活[34]。AR也有抑制Notch信号的功能，当AR表达上调时，Notch1和Jag1的表达受到抑制[41]。说明在正常状态下，Notch信号通路和AR信号通路彼此相互制约，维持稳态，有利于前列腺细胞的正常发育和分化。但在前列腺癌中该平衡被打破，一方面在前列腺癌细胞中AR可促进Notch配体Jag1的过表达；另一方面，在AR阴性的前列腺癌细胞系DU145和PC3中过表达AR和Jag1，其促增殖能力与AR阳性前列腺癌细胞系LNCaP单独过表达Jag1较一致，提示二者存在协同作用。AR和Notch的同时激活，可以增加Akt的磷酸化水平和cyclin B1的表达水平，促进前列腺癌细胞的增长[21]。PI3K-Akt-mTOR在前列腺癌的发病中，起着重要作用，Notch1可通过促进Hes1的表达，激活PI3K-Akt-mTOR促进前列腺细胞增殖，Hes1可以与PTEN启动子结合抑制PTEN的表达，从而导致PI3K-Akt-mTOR的激活[14，16]。由此可见，Notch信号对前列腺癌的调控是和多条通路协同完成的。

5 Notch信号分子作为肿瘤治疗靶点研究

既然Notch转导通路在肿瘤发生和进展中起着如此关键的作用，那么纠正Notch信号通路的异常改变将会成为治疗肿瘤的一个重要突破，目前，针对以Notch信号分子作为肿瘤治疗靶点的研究已开展很多，但真正应用于临床还有很长的一段距离。目前，主要有两种途径可以改变Notch信号通路：第一种是通过Notch受体和配体的单克隆抗体阻断Notch信号的转导；第二种是通过小分子抑制物(如：γ分泌酶机制剂)抑制Notch信号分子或下游靶基因的表达[2]。小分子抑制物的作用是广泛的，特异性较差，一般副作用很大，例如γ分泌酶抑制剂会使肠干细胞内的Notch信号也发生失活，使得肠干细胞向杯状分泌细胞分化增加，产生严重的胃肠道的毒副作用[42]。单克隆抗体的特异性和持久性较好，但需要对不同肿瘤内Notch信号异常的机制具备全面的细节的了解，以便制备特异性抗体，例如Notch1发生突变导致的Notch信号通路异常激活，可制备针对突变Notch1的抗体纠正Notch信号通路的异常激活。关于Notch信号分子作为治疗靶点在前列腺癌中的研究尚处于不成熟的阶段，并不推荐用于临床前列腺癌患者[43]，目前，需要对Notch信号在前列腺癌中的作用机制进一步全面深入的研究，以便开发出特异性强的Notch信号分子治疗靶点药物应用于临床。

综上所述，Notch信号转导通路的调控紊乱在前列腺癌的发生、转移和复发过程中都起着至关重要的作用。虽然Notch信号分子在前列腺癌中发挥原癌基因或是抑癌基因功能尚存在一定的争议，但是我们不能简单地理解成为两种对立的观点。因为Notch信号的多功能性和前列腺癌的多基因成因性，决定了Notch信号对前列腺癌的调控具有多功能性和复杂性。不同基因异常导致的前列腺癌中，Notch信号的表达可能是不同的，同时Notch信号对前列腺癌的调控也不是由其独立完成的，需要与多条通路联合调控，所以在前列腺癌中，Notch信号通路的异常有可能是由通路信号分子本身的突变导致的，也可能是受到其他因素的调控。总之，要想以Notch信号分子作为前列腺癌的治疗靶点，必须个体化地全面了解前列腺癌的致病机制，筛选出高效特异的Notch信号分子靶点药物，维持Notch信号转导通路的稳态，达到治疗前列腺癌的目的。

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