程序性细胞死亡受体1抑制剂nivolumab治疗肺癌研究进展

袁 洋，魏雨菲，高稳稳，范庆玲，于海川

(新乡医学院医学检验学院 河南省分子诊断与医学检验技术协同创新中心，河南 新乡 453003)

肺癌是发病率和致死率均高的恶性肿瘤[1]。肺癌患者就诊时往往已属晚期，尽管有手术、放射治疗、化学治疗等综合治疗手段，但其预后极差，5 a生存率仅约2%[2-5]。近年来，随着程序性细胞死亡受体1(programmed cell death 1，PD-1)、程序性细胞死亡受体-配体1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)等免疫检查点分子的发现，使肿瘤的免疫疗法进入临床试验阶段，并取得了良好的效果，达到了预期目标，开启了肿瘤免疫治疗的新篇章[4]。PD-1是一种免疫抑制性受体，主要表达于活化的细胞表面如T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞等，其配体有2种：PD-L1和PD-L2[5-6]。PD-L1广泛表达于肿瘤细胞、抗原提呈细胞、淋巴细胞、造血细胞和上皮细胞，PD-L2则表达于树突状细胞和巨噬细胞[7]。当PD-1与PD-L1、PD-L2结合后会传递免疫抑制信号而抑制T淋巴细胞的活化，造成T淋巴细胞无法吞噬肿瘤细胞，使肿瘤细胞逃脱机体的免疫监视，进而导致肿瘤的发生[7]。Nivolumab是第1个人源化抗PD-1的单克隆抗体，与PD-1结合后可以激活免疫细胞，干扰PD-L1、PD-L2与PD-1的相互作用，增强宿主的抗肿瘤反应[8-9]。本文对近年来PD-1抑制剂nivolumab治疗肺癌的相关研究进展进行综述。

1 肿瘤免疫治疗

肿瘤免疫治疗是通过主动或被动方式使机体产生肿瘤特异性免疫应答，恢复和增强机体免疫系统活性，使其充分发挥抑制和杀伤肿瘤细胞的功能[10]。肿瘤免疫治疗被称为继手术治疗、放射治疗、化学治疗后的第4种疗法，具有较高的安全性和更好的疗效，是目前肿瘤治疗研究的热点。肿瘤免疫治疗的目的是增强组织适应性免疫反应的特异性和长期记忆，以提高或恢复免疫系统功能，通过克服肿瘤免疫逃逸机制和抑制免疫反应，追踪并破坏肿瘤细胞，以实现肿瘤的持久消退和可能性治愈[11-13]。

肿瘤免疫治疗主要包括肿瘤疫苗、过继性细胞治疗、免疫检查点阻断等。肿瘤疫苗的原理是将基于肿瘤突变而产生的抗原导入患者体内，激活机体产生细胞免疫应答和体液免疫应答，逆转肿瘤所造成的机体免疫抑制状态，由此预防肿瘤的发生，并及时清除肿瘤细胞。肿瘤疫苗是近年来肿瘤免疫治疗的研究热点之一，根据其来源可分为肿瘤细胞疫苗、多肽疫苗及核酸疫苗等。过继性细胞治疗是高度个体化的治疗方法，其是从患者体内分离出免疫活性细胞，在体外进行诱导、分化、改造、扩增和功能鉴定，然后输回患者体内，从而直接或通过激活机体的免疫应答来杀伤肿瘤细胞。过继性细胞治疗主要包括非特异性免疫疗法和特异性免疫疗法。非特异性免疫疗法包括淋巴因子激活杀伤细胞疗法和细胞因子介导杀伤细胞疗法；特异性免疫疗法包括肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)、T淋巴细胞受体及嵌合抗原受体T淋巴细胞免疫疗法等。免疫检查点是通过配体和受体的相互作用在肿瘤的免疫信号通路中调节免疫应答来维持自身的免疫耐受，同时还参与肿瘤的免疫逃逸过程。免疫检查点阻断的基本原理是采用共抑制信息分子(或配体)的单克隆抗体来阻断信号通路，激活处于抑制状态的T淋巴细胞，增强T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的能力。目前，临床最常用的免疫检查点抑制剂有CTLA-4类抑制剂和PD-1/PD-L1类抑制剂，其在包括肺癌在内的多种恶性肿瘤的临床治疗研究中已取得显著成果。

2 PD-1及其配体在肿瘤发展中的作用

2.1PD-1PD-1(CD279)是通过消减杂交技术在凋亡的T淋巴细胞杂交瘤中发现的一种免疫共抑制分子，它是由268个氨基酸组成的Ⅰ型跨膜蛋白，是CD28家族成员之一[13]。人的PD-1基因存在于2q37.3染色体，由5个外显子和4个内含子组成，全长9.6 kb，其上游包含663 bp的启动子。PD-1在结构上主要由胞外免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)V样结构域、疏水跨膜区及胞质区3部分组成，有4个重要的N连接糖基化位点，该结构可能与诱导负性免疫应答相关，胞质区保留有免疫受体酪氨酸依赖抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs，ITIM)及免疫受体酪氨酸转化基序，这些基序可与磷酸化酶结合引起PD-1介导的免疫抑制[14]。研究发现，PD-1不仅表达于活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞及单核细胞等，还可表达于一些肿瘤细胞[5]。

2.2PD-L1和PD-L2PD-1主要有2个配体：PD-L1(B7-H1、CD274)和PD-L2(B7-DC、CD273)。PD-L1作为B7超家族的成员，是PD-1的主要配体，位于9q24染色体，长42 kb，PD-L1基因编码290个氨基酸，胞外区各存在1个IgV及IgC结构域，胞内区有蛋白激酶C磷酸化的位点，胞内区与PD-1有6%的同源性，提示其可能有信号传输功能。PD-L1除了在肺癌、乳腺癌、黑色素瘤等多种肿瘤组织中有较高的表达外，还广泛表达于活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞和树突状细胞等肿瘤相关抗原提呈细胞及多种间质细胞、血管内皮细胞和心脏、肝脏、胎盘组织等[7]。PD-L1能发挥共刺激性与共抑制性双重功能。有研究认为，PD-L1与PD-1结合主要介导免疫抑制，其共刺激功能的发挥是由于PD-1和T淋巴细胞受体聚集与配体PD-L1结合后再短暂结合含Src同源区2蛋白酪氨酸磷酸酶2(src-homology domain 2 containing protein-tyrosine phosphatase-2，SHP2)生成共刺激微簇，诱导近端T淋巴细胞受体信号分子去磷酸化，从而抑制T淋巴细胞的激活[15]。

PD-L2与PD-L1具有很高的相似性，其在体内的分布及表达相对比较局限，主要在活化的巨噬细胞及树突状细胞表面进行选择性表达，在胰腺及肝脏等组织中也可见较高的表达[16]。与PD-L1类似，PD-L2与PD-1结合也可以传递抑制性信号。研究发现，PD-L2在肿瘤细胞表面表达相对较少，且其存在潜在的共刺激分子受体即排斥导向分子b(Repulsive guidance molecules b，RGMb)，提示其抑制机体抗肿瘤免疫的作用较小[17]。

2.3PD-1/PD-L1信号通路与肿瘤发生PD-1/PD-L1信号通路与多种疾病的发生相关。生理状态下，该通路能够保持自身组织抗原的免疫耐受性，也能够防止过度免疫反应，避免自身组织器官的损害，从而维持人体的免疫平衡状态[14]。PD-1/PD-L1信号通路主要在肿瘤发生过程中参与免疫逃逸。机体处于肿瘤微环境时，T淋巴细胞被激活而高表达PD-1，肿瘤细胞则高表达PD-L1，从而使PD-1/PD-L1信号通路在肿瘤微环境中处于持续激活状态，此时细胞内磷酸化的ITIM会通过招募SHP2磷酸酶类分子，激活Ras和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路，抑制下游T淋巴细胞的活化，包括抑制T淋巴细胞增殖和相关细胞因子生成，使得T淋巴细胞功能被抑制，转导抑制性信号，而肿瘤细胞表面的PD-L1可作为受体向肿瘤细胞内传递负性信号，促使肿瘤细胞抵抗免疫效应，从而发生肿瘤免疫逃逸[15，18]。肿瘤组织微环境中的主要效应细胞TIL表面高表达PD-1，肿瘤细胞表面的PD-L1可与TIL表面的PD-1结合，从而影响TIL的活化并诱导其凋亡[19-20]。PD-L1还可以抑制TIL释放相关炎性介质，显著抑制TIL的免疫杀伤活性，促进肿瘤发生免疫逃逸[13，17]。有研究证明，癌细胞表面的PD-L1能够与活化的肿瘤抗原特异性CD8+T淋巴细胞上的PD-1结合，激活并传递抗Fas系统的凋亡信号，诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞凋亡，降低其杀伤力，同时影响树突状细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞等的分化、发育及功能成熟，使得肿瘤细胞发生免疫逃逸，促进肿瘤发展[21-22]。通过阻断PD-1/PD-L1信号通路可以有效地激活处于免疫抑制状态的T淋巴细胞，阻断肿瘤发生免疫逃逸，有效抑制肿瘤的发生和发展。目前，应用于临床研究的PD-1/PD-L1免疫抑制剂抗体，如IgG4类抗PD-1单抗nivolumab主要用于治疗不可切除或者晚期转移性黑色素瘤、晚期难治性肺鳞状细胞癌、转移性鳞状非小细胞肺癌及经典霍奇金淋巴瘤；人源化PD-1单抗lambrolizumab和高度选择性拮抗PD-1的人源化IgG4-κ同型抗体keytruda主要用于治疗黑色素瘤；高度特异性的人源化单克隆IgG4类抗PD-1抗体pembrolizumab主要用于治疗不能切除或转移性黑色素瘤、晚期黑色素瘤、膀胱癌、头颈部癌、非小细胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma，NSCLC)和胃癌。以PD-L1蛋白为靶点的人源化IgG单抗atezolizumab(MPDL3280A)主要用于NSCLC和尿路上皮膀胱癌的二线治疗及肾细胞癌、转移性尿路上皮膀胱癌、转移性非小细胞肺癌、难治性淋巴瘤、转移性黑色素瘤的研究。

3 Nivolumab

Nivolumab是一种抑制PD-1受体的人源化IgG4型单克隆抗体，表达于活化的CD4+和CD8+T淋巴细胞、自然杀伤细胞、B淋巴细胞、单核细胞以及某些肿瘤细胞和肿瘤浸润的淋巴细胞。Nivolumab与PD-1结合可阻断PD-1与PD-L1/PD-L2的相互作用，激活PD-1/PD-L1信号通路介导的免疫应答，改变肿瘤微环境，恢复T淋巴细胞抗肿瘤活性及相关适应性免疫应答，抑制肿瘤细胞生长和靶向杀伤肿瘤细胞。在结构上，nivolumab主要通过重链结合PD-1和轻链的空间位阻效应来阻断PD-1与PD-L1的相互作用；其结合PD-1分子后能够产生空间位阻，从而阻止PD-L1进一步结合PD-1分子，阻断PD-1与PD-L1的相互作用[23]。目前，nivolumab已应用于黑色素瘤、肺癌以及肾细胞癌等多种肿瘤的临床治疗，效果明显优于以往的化学治疗和放射治疗。

4 Nivolumab在肺癌中的应用

4.1Nivolumab在NSCLC治疗中的应用肺癌是世界上癌症死亡的主要原因之一，患者确诊时通常已属晚期[24]。NSCLC约占肺癌的85%，包括鳞状细胞癌和非鳞状细胞癌2种组织学亚型，分别约占NSCLC的30%和70%[25]。GETTINGER等[26]在NSCLC Ⅰ期剂量扩展队列研究中对296例晚期NSCLC患者进行了各项评估，结果显示，经nivolumab治疗的NSCLC患者的客观缓解率(objective response rate，ORR)为17.1%，1、2、3 a生存率分别为42.0%、24.0%、18.0%，中位总生存期(overall survival，OS)为9.9个月，鳞状细胞癌与非鳞状细胞癌患者的ORR分别为33.0%和12.0%，但2组患者中位OS均为9.9个月，该研究将3 mg·kg-1定为后续研究的标准剂量，首次提出肿瘤细胞中PD-L1的表达可能与ORR相关；经过3 a随访，参与该研究的鳞状细胞癌和非鳞状细胞癌患者的OS率均为18.0%，与后期LIM等[27]和ZAGO等[28]研究结果相似；5 a随访，患者的总生存率约为16.0%，鳞状细胞癌和非鳞状细胞癌患者的总生存率无差别，并发现PD-L1表达阳性的患者经nivolumab治疗后能获得较多的生存益处[29]。1项Ⅱ期单臂临床研究(CheckMate 063)纳入了117例至少接受过二线化学治疗的晚期肺鳞状细胞癌患者，经nivolumab治疗后，评估结果基本与Ⅰ期相似，患者的ORR为14.5%，中位反应时间为3.3个月，疾病稳定的中位持续时间为6.0个月，无进展生存期(progression-free survival，PFS)为1.9个月，6个月和1 a无进展生存率分别为25.9%和20.0%，OS为8.2个月。并发现 PD-L1阳性表达患者的ORR较高，但由于样本量小，可信区间较宽，结果有待考究[30]。LENA等[31]对参与CheckMate 063试验研究的117例NSCLC患者进行2 a的随访，患者的中位OS为8.1个月，ORR为15.0%，证明nivolumab在晚期肺鳞状细胞癌治疗中安全有效。Ⅲ期肺鳞状细胞癌临床试验研究(CheckMate 017)纳入了272例患者，对比nivolumab与docetaxel对难治性肺鳞状细胞癌患者的疗效，结果显示，nivolumab组患者的治疗效果明显优于docetaxel组，OS分别为9.2、6.5个月，PFS分别为3.5、2.8个月，ORR分别为20.0%和9.0%，但PD-L1表达与患者治疗效果和预后并无显著相关性[32]。同时，Ⅲ期CheckMate 057研究纳入了582例经含铂双药化学治疗失败的非鳞状细胞癌患者，评估nivolumab和docetaxel的治疗效果，发现nivolumab组患者的PFS和ORR均优于docetaxel组，并发现PD-L1表达能够明显预测nivolumab的治疗效果[33]。基于nivolumab在NSCLC二线治疗中优于docetaxel的效果，美国食品药品管理局批准nivolumab用于含铂双药联合化学治疗失败的肺鳞状细胞癌和非鳞状细胞癌的二线治疗。VOKES等[33]对参与CheckMate 017和CheckMate 057试验研究的NSCLC患者进行了3 a随访，发现nivolumab对晚期NSCLC患者的治疗效果仍优于docetaxel，总生存率分别为17.0%和8.0%，nivolumab对NSCLC肝转移患者的治疗效果也优于docetaxel，且患者耐受良好，安全有效。Nivolumab作为晚期NSCLC一线治疗的Ⅰ期研究中对52例NSCLC患者进行了疗效评估，结果显示，患者ORR为23.0%，中位PFS为3.6个月，中位OS为19.4个月，证明nivolumab可作为晚期NSCLC的一线治疗药物[34]。CheckMate 026研究对比了nivolumab和铂类化学治疗药物用于NSCLC一线治疗的效果，但该研究未达到改善PFS的主要研究终点[35]。CheckMate 012试验研究结果显示，nivolumab联合ipilimumab一线治疗晚期NSCLC与nivolumab单药治疗相比，患者的PFS延长了1倍[36]。Ⅲ期CheckMate 227临床研究进一步评估了nivolumab联合ipilimumab作为晚期NSCLC一线治疗的有效性和安全性，结果基本与CheckMate 012一致，并发现高肿瘤突变负荷(tumor mutation burden，TMB)患者的PFS延长，认为TMB可以作为一种重要的独立预测标志物，鉴别能够从nivolumab和ipilimumab联合治疗中获益的一线NSCLC患者群体[37]。最近研究发现，与其他化学治疗药物比较，nivolumab治疗的老年NSCLC患者(年龄≥65岁)的OS和PFS均延长，但75岁以上的患者由于免疫功能减退，总生存率并未显著升高[38]。

近年来，免疫疗法已经成为晚期NSCLC的有效治疗方法，虽然NSCLC患者在接受治疗过程中疾病进展缓慢，但仍会发生转移，预后差，转移性NSCLC患者的中位OS约为12个月，5 a生存率仅为1%，亟需新的治疗方法[39]。原发肿瘤可以作为抗原的来源，用于肿瘤特异性T淋巴细胞的扩增和活化以及对微转移酶的系统监视，因此，新辅助免疫疗法已成为新的研究热点，也为研究PD-1在原发性肿瘤微环境和外周血中被阻滞提供了机会[40]。有研究显示，CD8+T淋巴细胞水平较高的患者存活期延长。新辅助佐剂抗PD-1/CD137导致在肿瘤被切除后，患者血液中肿瘤特异性CD8+T淋巴细胞仍会持续增多。如果肿瘤仅仅处于休眠状态，那么长期存活下来的T淋巴细胞和自然杀伤细胞并不会减少，这表明，在新辅助免疫治疗下，肿瘤细胞会被永久杀死[41]。Nivolumab新辅助免疫治疗第2阶段试验(NSCLCNCT02259621)的中期结果良好，患者手术前2周注射nivolumab不会延迟手术且耐受良好，安全有效，经过12个月的随访仅有10%的患者术后复发[40]。目前，这项研究不断扩大，除了nivolumab新辅助免疫治疗研究外，nivolumab联合ipilimumab在新辅助治疗中的应用也在开展，结果令人期待。

4.2Nivolumab在小细胞肺癌(smallcelllungcancer，SCLC)治疗中的应用对化学治疗、放射治疗十分敏感的恶性SCLC约占14%，其倍增时间短，易发生继发性耐药，出现复发和转移等[42]。Ⅰ/Ⅱ期 CheckMate 032试验评估了nivolumab单抗及其联合ipilimumab治疗复发性SCLC的疗效和安全性，该试验纳入了216例一线铂类化学药物治疗失败的患者，随机分为3组，分别给予nivolumab单抗3 mg·kg-1、nivolumab 1 mg·kg-1+ipilimumab 3 mg·kg-1、nivolumab 3 mg·kg-1+ipilimumab 1 mg·kg-1进行治疗，研究表明，nivolumab与ipilimumab联合治疗可以获得良好的效果，3组患者的ORR分别为10.0%、23.0%、19.0%，中位PFS分别为1.4、2.6、1.4个月，中位OS分别为4.4、7.7、6.0个月，患者1 a总生存率分别为33.0%、43.0%、35.0%[43]。CheckMate 032试验的后续研究结果显示，联合治疗和单药治疗患者的ORR分别为22.0%和11.0%，进一步证实了nivolumab与ipilimumab联合治疗方案的优势，总体安全和风险基本持平，使患者耐受持久并延长生存期[44]。因此，美国国家癌症治疗准则委员会将nivolumab联合ipilimumab作为二线治疗复发SCLC的一个选择。同时，CheckMate 451试验研究表明，nivolumab联合ipilimumab可以用于有限阶段和广泛阶段SCLC标准治疗后的维持治疗[45]。Ⅲ期CheckMate 331试验比较了nivolumab与拓扑替康或氨柔比星对一线治疗失败的SCLC患者的治疗效果，结果尚未公开。

4.3预测nivolumab治疗效果的生物标志物Nivolumab用于肺癌的临床研究中，其无论是一线还是二、三线治疗、单用或联合治疗均取得了一系列的成果，为了能够合理选择获益人群，寻找预测PD-1受体抑制剂治疗效果的生物标志物的研究也在持续展开。PD-L1是目前作为预测PD-1受体抑制剂治疗效果的生物标志物，表达于肿瘤细胞和浸润肿瘤细胞的免疫细胞表面，是一种动态的生物标志物[4]。多数研究表明，PD-L1表达与nivolumab的治疗效果有关，也有研究表明，无论PD-L1阳性表达还是阴性表达，nivolumab均有一定的疗效[29-32]。随着PD-L1检测状态的成熟和标准化，PD-L1作为单一的生物预测标志物表现出缺陷[46]。TMB是一种新型的、独立的生物标志物，参与多种肿瘤的免疫治疗，其中包括肺癌。HELLMANN等[37]验证了CheckMate 227试验，该研究结果提示，TMB和PD-L1均表达的晚期NSCLC患者，选择nivolumab+ipilimumab作为一线治疗，将会获得生存益处。TMB与PD-L1的表达相结合可作为独立的生物标志物存在，预测获益人群。除此之外，PD-L1低表达的患者对nivolumab的部分响应可能与B淋巴细胞和IgG显著积累有关，但尚需要大样本研究来验证[47]。BOUTSIKOU等[48]研究发现，血清细胞因子水平如肿瘤坏死因子-α、干扰素γ及白细胞介素等可提供预后信息，可作为晚期NSCLC患者对PD-1受体抑制剂选择的预测标志物。生物标志物的研究发现能够为临床医生快速选择合理的用药方案和获益人群提供帮助，为进一步阐明药物疗效与PD-LI表达的关系提供基础。

5 展望

免疫检查点抑制剂能够诱导持久的肿瘤控制，免疫抑制剂抗体的发现促进了肿瘤免疫学治疗的发展，并表明调节免疫应答是治疗肿瘤的关键策略。PD-1和CTLA-4可以“检查”免疫检查点的不同部分：CTLA-4从根本上调节最初的T淋巴细胞活化，而PD-1主要调节免疫效应应答位点的免疫攻击。抗PD-1治疗和现有的肿瘤疗法例如化学疗法、肿瘤疫苗接种、肿瘤特异性T淋巴细胞克隆体外扩增、细胞因子等结合，可为肿瘤患者提供了新的希望。然而，已知的PD-1抗体也有一定的不良反应，主要包括Ⅰ型糖尿病、皮疹、重症肌无力、肠炎等，仍不容忽视。目前，用于预测特定类型的免疫检查点抑制剂治疗效果的生物标志物处于紧张地研究中，为更清楚地了解这些免疫检查点的调节作用以及阐明T淋巴细胞功能障碍的机制提供基础，也将会揭示肿瘤新疗法的未来发展方向。

PD-1/PD-L1通路的免疫治疗在不同类型的肿瘤以及不同个体间的疗效存在差异，而且可能会造成除肿瘤以外的免疫损伤。肿瘤疫苗的开发在一定程度上带来了益处，但是反过来又增加了患癌的风险。抑制机体的固有免疫和适应性免疫应答将是提高抗癌免疫力的良好方法。但是，由于肿瘤免疫机制复杂，PD-1/PD-L1靶向治疗可提高肿瘤患者生存率的机制尚未完全阐明，许多问题仍待解决。

PD-1受体抑制剂nivolumab无论是作为一线或二、三线，单药或联合用药，在NSCLC治疗中均取得了良好的效果，在晚期转移性NSCLC中的试验结果也令人振奋。对于年龄>75岁的NSCLC患者，由于免疫功能衰退，nivolumab治疗并未延长患者的生存期，需要更多的临床试验进一步观察。对于复发率高且预后极差的SCLC患者，nivolumab主要与其他药物联合作为二线治疗，为SCLC患者带来了新的希望。为了能够帮助临床医生快速合理地选择用药方案和获益人群，用于预测nivolumab治疗效果的生物标志物的研究也在不断推进。对于PD-1受体抑制剂药物治疗肺癌来说，nivolumab治疗所伴随的不良反应发生率较低。即便如此，nivolumab用于肺癌的临床应用研究仍存在着诸多问题，如PD-L1表达与nivolumab治疗效果的关系及作用机制、探索最优的治疗方案、确定免疫治疗的疗效评价标准等。但是，随着研究的深入，相信这些问题将会逐步得到解答，从而更加及时、有效、合理地选择nivolumab治疗方案，提高不同类型和不同时期的肺癌患者的生活质量，延长生存期。