细胞死亡在肝移植缺血再灌注损伤中的研究及治疗进展

钱泽，陈迪宇，吴健，郑树森

浙江大学医学院附属第一医院肝胆胰外科，浙江杭州 310003

细胞死亡是一种基因指导的细胞自我消亡方式，一般可以由外部条件刺激触发引起的，但在免疫调节以及免疫系统发育过程中，细胞死亡也可以在生理条件下发生（这种情况下，该过程又被称为程序性细胞死亡）[1-3]。引起细胞死亡的原因很多，一切损伤因子只要作用达到一定强度或持续一定时间，从而使受损组织的代谢完全停止，就会引起细胞、组织的死亡[4,5]。细胞死亡可以根据其细胞形态学分成三类：凋亡（I类细胞死亡），自噬（II类细胞死亡）以及坏死（三类细胞死亡）。而缺血再灌注损伤作为影响移植手术患者预后的重要预后因素，引起了不少学者的研究和重视[6-7]。其中，对于细胞死亡在肝脏缺血状态下所发挥的作用更是不容小视。但目前国内外有关细胞死亡在肝移植缺血再灌注损伤的研究并不是很多，尚面临诸多问题亟需解决。该文旨在通过回顾肝移植缺血再灌注损伤中各种类型细胞死亡在其中的作用机制及探讨针对细胞死亡所提出的的减少缺血再灌注损伤的治疗策略的可行性及其中所存在的主要问题。

1 细胞死亡在器官移植中的发生机制

对于细胞死亡的进一步深入发现，让对于移植器官中细胞的变化有了新的认识。凋亡作为细胞死亡的主要形式，已经成为肿瘤领域的主要研究方向，许多凋亡相关的调节药物也开始进入临床试验阶段，获得较好的治疗效果。移植物的缺血再灌注损伤包括冷缺血再灌注损伤、热缺血再灌注损伤，是引起移植器官功能缺陷及移植受体预后不良的主要原因[8]。虽然引起再灌注损伤的机制相当复杂，研究证据表明，在缺血再灌注损伤中，凋亡起到主要的调节和发生机制。

1.1 BCL-2在缺血再灌注损伤中作用

Bcl-2基因 (即B细胞淋巴瘤/白血病-2基因)是一种癌基因，它具有抑制凋亡的作用，能抑制p53介导的凋亡[9-11]。Bilbao等[12]运用腺病毒将bcl-2基因转移到老鼠的肝脏，发现BCL-2过表达小鼠的肝脏可以显著抵抗缺血性损伤，降低转氨酶的释放量，减少肝细胞的凋亡。并且在BCL-2过表达后，相对于对照组，实验组的小鼠存活时间更长。Selzner等人[13]在转基因小鼠中使BCL-2基因过表达，发现调往相关的蛋白酶caspase 3的基线水平明显升高。Yamabe等人通过构建小鼠缺氧模型发现在缺氧环境下，过表达bcl-2基因对于肝细胞的死亡具有保护作用。

1.2 TNFα在缺血再灌注早期发挥作用

TNFα（肿瘤坏死因子）在缺血再灌注损伤中具有双重作用[14]。可以TNF受体相结合，其中TNFR I中包含死亡结构域（TRADD），与TNFα结合后可以诱导凋亡。TNF受体II没有胞内的死亡结构域，其胞内结构域能与抗凋亡分子相结合，例如TRAF和IAP，从而产生抗凋亡作用。目前，为了研究TNF的作用，常用阻断TNFα信号通路的方法为：①使用抗TNFα的血清；②使用己酮可可碱（为甲基黄嘌呤产物 ，可以阻止TNF的合成以及其在Kupffer细胞中的释放）；③使用TNF受体的基因敲除小鼠模型。使用己酮可可碱和基因敲除小鼠模型发现证明，通过对移植组小鼠肝脏的形态学分析发现TNFα低表达可以在缺血再灌注损伤初期诱导肝细胞凋亡，说明TNF具有抵抗缺血再灌注损伤的作用。

1.3 库普弗细胞在缺血再灌注损伤中诱导凋亡

在肝脏的缺血状态时，激活的库普弗细胞（Kupffer cell）可以增加肝细胞的再灌注损伤[15]。在激活后，库普弗细胞可以释放出多种潜在的危害介质，包括TNFα、活性氧化合物。其中，在较高的活性氧化合物释出的氧自由基浓度下，可以诱导脂质发生氧化。这一效应可以导致细胞膜功能障碍，从而引发细胞死亡。并且释放的高活性氧自由基可以和TNFα结合，启动TNFα诱导凋亡机制，对于实质细胞的缺血性损伤的启动具有重要意义。

1.4 能量代谢和离子通道改变对再灌注损伤中凋亡的影响

缺氧的刺激可以引起缺血肝脏线粒体的通透性发生改变，导致线粒体内膜的跨膜电位下降，ATP合成水平显著减少。一方面，细胞Na+/K+ATP酶活性降低，Na+/K+离子平衡紊乱，导致线粒体肿胀、外膜破裂释放膜间腔内容物包括凋亡诱导因子、细胞色素C等，从而引发细胞凋亡。另一方面，肝细胞内的Ca2+-ATP酶活性也可以被抑制，当 Ca2+在细胞内潴留，导致Ca2+超载，活化蛋白酶 C使 G蛋白磷酸 化，G蛋白减少，胞内 cAMP浓度减低，从而诱导凋亡[16]。

2 坏死性凋亡（Necroptosis）与缺血再灌注损伤

坏死性凋亡是坏死的一种特殊类型，不仅参与机体的生理性调节过程,一些具有坏死表型疾病的发生、发展及预后与坏死性凋亡的活化直接相关[17]。随着研究的深入，发现坏死性凋亡在缺血再灌注损伤也起到重要的作用。

2.1 坏死性凋亡在缺血再灌注损伤的发生机制

坏死性凋亡与凋亡存在共有上游调控元件，其中肿瘤坏死因子受体1（TNFR I）是其中最为深入研究的一个。在缺血条件下，TNFα被活化后可以与实质细胞膜伤的肿瘤坏死因子受体1相结合，其结构域中的死亡结构域 （TRADD）可以调控下游RIPK1的表达，招募RIPK3组成坏死体（Necrosome）。并且，坏死性凋亡可以被caspase 8这个关键酶所调节。当caspase 8被激活时，活化的caspase 8可以和FADD、RIPK1组装形成诱导凋亡发生的复合物；而当caspase 8活性被抑制时，RIPK1、RIPK3可以同RIP同型结构域（RHIM）发生相互作用，引发坏死性凋亡。

2.2 坏死性凋亡与移植物免疫排斥相关

当细胞发生在缺血状态下发生坏死后，死细胞释放胞质内容物和细胞死亡相关的模式分子(CDAMPs)，例如热休克蛋白（HSP）、HMGB1、核酸、纤连蛋白等，这些小分子不仅可以诱导移植受体的早期固有免疫，还可以和Toll样受体结合，产生特异性免疫反应，从而加重缺血再灌注损伤及移植物的排斥反应[18]。

3 自噬在缺血再灌注损伤中的作用

经过研究发现，肝内的第一个细胞被IRI损伤的是肝脏窦腺状内皮细胞(LSEC)。更多证据表明，LSEC在肝脏应对多种损伤时具有调节和协同作用[19]。肝细胞在缺氧缺血状态下也可以发生自噬，使得线粒体膜和蛋白恢复，起到保护肝脏基本生命活动的作用。所以，肝脏缺氧环境下的自噬过程被越来越多的学者认为是重要的IRI细胞自我保护机制。

3.1 缺血再灌注损伤LSEC自噬激活机制

在LSEC中，自噬的上游激活通过对AMPK和ULK1信号路径的整合来进行调节。AMPK可以在细胞缺氧状况下感受胞内ATP水平下降，使得细胞内钙离子水平升高。LSEC通过钙离子与钙相关蛋白结合，活化 AMPK 激酶 β（CaMKK-β）。CaMKK-β 从而可以使AMPK通路激活，并且AMPK可以磷酸化结节性硬化基因（TSC2），进一步抑制mTOR的表达，同时让ULK1的表达量升高，从而激活自噬过程。因此，在LSEC中自噬的激活是一种AMPK与细胞内钙离子、AMPK、ULK1动态相互作用的结果。与此同时，肝脏血流阻断可以引起局部组织缺氧，使得活性氧（ROS）浓度升高，激活Sirt1基因的表达。一方面，Sirt1可以将ATG5、ATG7、ATG8去乙酰化；另一方面，Sirt1也可以通过AKT途径激活FOXO1和FOXO3，从而激活自噬过程[20-21]。

3.2 缺血再灌注损伤肝细胞自噬激活机制

Lee等人[22]通过对缺血小鼠和对照组进行比较，发现移植小鼠的活性氧ROS浓度增高，线粒体被氧化失活，被同位素标记的线粒体蛋白大量溢出膜外被检测发现。Khader等[23]进一步探索发现，缺血状态下的移植小鼠肝细胞可以在ROS刺激下诱导Sirt1活化，激活自噬过程并且促进线粒体膜电位及线粒体内相关蛋白恢复，起到减少缺血再灌注损伤的作用，对移植肝脏起到一定的保护作用。但是具体机制还有待进一步的研究。

4 抗细胞死亡治疗与防治肝移植缺血再灌注损伤

4.1 抗凋亡治疗

随着研究的深入，发现研制了多种凋亡抑制剂，运用凋亡抑制剂可达到保护肝功能的目的，但对它的研究仍处于体外实验或者动物实验水平。其中主要包括：①蛋白水解酶抑制剂：蛋白水解酶作为凋亡通路中的关键分子，在缺血再灌注损伤治疗显得尤为重要。Cursio等[24]发现使用特异性蛋白水解酶抑制剂（Z-Asp-cmk）后，与对照组相比小鼠模型的血清转氨酶减少了一半，而且动物的长期生存率在使用抑制剂后从30%增加到95%。而且，caspase3等凋亡相关蛋白的表达量也呈现出明显降低的趋势。②外源性cAMP的导入：随着发现局部cAMP的浓度升高，可以显著改善肝细胞缺血再灌注损伤，有研究将供体cAMP直接加入到小鼠肝细胞的培养基中发现肝细胞的凋亡明显减少，并呈现浓度梯度相关性。③抗氧化剂的应用：N-乙酰半胱氨酸 (NAC)、巯基还原剂、氧化苦参碱、超氧化物歧化酶、DMPO和TEMPO等可减轻缺血再灌注时由自由基产生的细胞凋亡现象，从而减轻组织损伤。④针对BCL-2基因特异性治疗：ABT-263和ABT—199是两种已经被FDA批准的BCL-2特异性抑制剂，目前正在实体肿瘤和血液系统肿瘤中进行临床试验。该两种药物对于抗凋亡过程具有较好的疗效，使得组织损伤程度减小[25]。⑤其他抗凋亡治疗：在临床研究中富氢气灌流液、NO气体保护等方法逐渐被运用到肝移植器官保存当中，在动物实验中取得了一定效果，但其中的机制需要进一步的探索。

4.2 抗坏死性凋亡治疗

坏死性凋亡肝脏中主要通过 RIPK1、RIPK3、MLKL等几个个关键基因在缺血再灌注损伤中发挥作用，对于提出了相应的抗坏死性凋亡的治疗方法：①RIPK1抑制剂：Necrostatin1是在 2005年发现RIPK1的特异性抑制剂，但是其分子结构与IDO抑制剂相似，可以破坏机体的免疫耐受力，诱导TNF介导的SIRS反应出现[26]。经过化学分子结构修饰后，Nec-1在Necrostatin1的基础上消除了IDO抑制作用，Glaxo团队使用荧光偏振分析法发现Nec-1可以以RIPK1特异性结合，从而抑制RIPK1和RIPK3结合形成坏死小体（necrosome），起到抑制坏死性凋亡的作用。②RIPK3抑制剂：GSK840，GSK843 ，GSK872为迄今为止发现的三种RIPK3抑制剂[27]，可以竞争性和RIPK3受体结合，减少坏死性凋亡的发生。但是GSK843，GSK872在高浓度状态下可以诱导 TNFRIPK1依赖性凋亡通路和caspase 8的激活，使得细胞凋亡增多。而GSK?840特异性最好，并且不会引起凋亡增多现象，值得进一步在临床研究中进行探索。③MLKL抑制剂：GW806742X可以特异性地抑制MLKL的假激酶结合位点，从而抑制RIPK1和RIPK3结合形成坏死小体[28]。

4.3 抗自噬治疗

使用NMP-L灌流的供肝和传统的供肝保存方法相比可以增加ATP水平，减少肝细胞自噬产生。在后期对DCD供肝的研究发现，和2 h的传统冷冻储存肝脏相比，暴露于1 h热缺血和2 h冷缺血后的肝脏继续用NMP-L灌流1 h后ATP可以增加将近80%[29]。然而，对于缺血再灌注损伤中如何减少自噬产生仍然需要进一步的研究和探索。

5 结语

肝脏缺血再灌注损伤是影响移植肝存活率的一个重要因素，细胞死亡又与肝脏的缺血再灌注损伤有着密切的联系，所以研究细胞死亡对于在缺血缺氧状态下肝细胞的影响有着极为重要的意义。在缺血再灌注早期和晚期，细胞死亡可以呈现出不同的作用，值得我们去进一步探索。然而，现今缺血再灌注损伤的研究仅仅停留在体外实验或者动物实验水平上，在进入临床使用仍需解决许多问题。但是随着研究的不断深入，各种类型的细胞死亡的抑制剂很有可能会呈现多样化的发展，并普及运用到临床肝脏保护当中去，减少肝脏缺血再灌注损伤，提高肝移植成功率，改善移植患者的生存预后。