宏基因组文库新型β-葡萄糖苷酶的筛选、克隆及酶学性质分析

唐乐丽，王晓萌，吴秀玲，黄 庆，李 荷*

（广东药科大学药学院，广东 广州 510006）

微生物资源在地球上的含量十分丰富，其中原核细胞数量和种类高达到6×1030～8×1030个[1]，微生物具有的多样性特质，为挖掘新酶、新的代谢物质和生物活性物质提供了一种新来源[2]。然而Bakken等[3]研究发现，自然界中高达99%的微生物是未培养微生物，即在目前的实验环境下是不能被培养生长的，如果利用传统培养微生物学的方法，只能获得地球上极少数微生物的活性物质，从而兴起了宏基因组技术，1985年，Pace等通过提取环境微生物总DNA法，成功研究了大量未培养微生物所携带的遗传学信息，这之后，许多研究者都通过此方法对未培养微生物进行了研究[4-5]。

β-葡萄糖苷酶（β-D-glucosidase，EC3.2.1.21），属于纤维素酶类，是3 种纤维素分解酶中的重要组成成分之一，它能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。β-葡萄糖苷酶有较广泛的工业应用，可用来降解纤维素[6-8]生产生物乙醇、改善食品风味、转化大豆异黄酮糖苷化合物、制备低聚龙胆糖、防治病虫害[9-11]等。但目前工业用β-葡萄糖苷酶多数来源于木霉等真菌及茶树类植物[12-13]，反应条件（如温度、pH值）适应范围相对较窄，且酶活力偏低，造成经济成本较高，制约β-葡萄糖苷酶的广泛应用[14-15]。而且生物酶应用于工业生产的条件比较苛刻，要求生物酶具有良好的热稳定性、有机溶剂耐受性、金属离子耐受性以及在特定pH值、温度条件下的高酶活力，因此需要发掘酶学性质更加优良的β-葡萄糖苷酶来提高工业生产效率，降低生产成本。宏基因组技术研究对象是微生物总DNA并独立于宿主之外进行研究，所获得的新基因一般都较完整，相似度也较低，可以用来大量筛选新的有开发前景的工业酶[16-18]。黑龙江玉米秸秆还田土壤中纤维素资源丰富，可能含有能够产生酶活力较高的β-葡萄糖苷酶微生物。本研究以黑龙江玉米秸秆还田土壤微生物为对象，构建其宏基因组文库，利用功能筛选方法，拟从文库中筛选具有酶活力较高的新型β-葡萄糖苷酶基因并对其酶学性质进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

土样采自黑龙江省牡丹江市郊区玉米秸秆还田土壤，采集表层下10～20 cm的土样，-20 ℃保存。Escherichia coli DH5α、E. coli BL21由本实验室保存。建库所用载体质粒pUC118、pET-32a（＋）购自大连TaKaRa公司。

XhoⅠ、EcoRⅠ等限制性内切酶、T4 DNA连接酶以及各种DNA MarkerPrime、STARTMMax Premix、蛋白质分子质量Marker 大连TaKaRa公司；DNA凝胶回收试剂盒（E.Z.N.A®Gel Extraction Kit）、质粒提取试剂盒（E.Z.N.A®Plasmid Mini Kit）、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）产物回收试剂盒（E.Z.N.A®Cycle-Pure Kit） 美国Omega公司；氨苄青霉素（ampicillin，Amp）、5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-α-D-galactopyranoside，X-gal）、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG） 美国Sigma公司；七叶苷、对硝基苯酚（p-nitrophenol，pNP），对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，pNPG） 生工生物工程（上海）有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

凝胶成像系统 美国BioTek公司；电泳仪 北京六一仪器公司；PCR仪 美国AB公司；恒温水浴锅上海精密实验设备公司；电击仪 美国Bio-Rad公司；Nanodrop2000c超微量紫外-可见光分光光度计 赛默飞世尔科技公司；PB-10型pH计 德国Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米秸秆还田土壤基因组总DNA的提取[19]及纯化

取4 个高压灭菌后的50 mL离心管，称取玉米土壤样品，每管6 g，各加DNA 提取缓冲液13.5 mL，涡旋振荡混匀后，放摇床220 r/min、37 ℃活化30 min。各管加1.5 mL质量浓度20 g/100 mL 的十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS），使其终质量浓度达到2 g/100 mL。在65 ℃水浴锅中水浴2 h，每隔30 min上下轻轻颠倒数次混匀。25 ℃、6 000 r/min离心10 min。将上清液转移至高压灭菌的50 mL高速离心管，加入等体积的氯仿-异戊醇（24∶1）混合液，上下轻轻颠倒混匀。25 ℃、11 000 r/min离心30 min。收集上清液，加入0.6 倍体积的异丙醇上下轻轻颠倒混匀，室温静置3 h以上。25 ℃、11 000 r/min离心30 min。弃上清液，用4 ℃预冷的75%乙醇溶液洗涤沉淀1 次。4 ℃、8 000 r/min离心10 min，弃上清液，放入60 ℃烘箱烘干。每管加0.2 mL 65 ℃预热的ddH2O，并65 ℃温浴5 min，溶解基因组DNA。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组DNA，并立即纯化回收基因组DNA。提取的粗基因组DNA用1.0%的琼脂糖进行琼脂糖凝胶电泳，使用Omega的DNA Extraction Kit回收并纯化所提取的玉米土壤基因组DNA。

1.3.2 玉米秸秆还田土壤宏基因组文库的构建

选择EcoRⅠ酶对提取纯化的玉米土壤DNA进行不完全酶切80 min，回收2.3～8 kb的DNA片段。将回收的酶切DNA片段连接到线性化的经EcoRⅠ酶切的克隆载体上，用TaKaRa T4 DNA Ligase于16 ℃连接12～16 h。对连接产物进行纯化：取出DNA酶切片段与载体的连接产物，加入2.5 倍体积-20 ℃提前预冷的无水乙醇和0.05 倍体积的3 mol/L乙酸钠轻轻混匀，-20 ℃沉淀1 h以上；4 ℃、12 000 r/min离心20 min；弃上清液，用-20 ℃预冷的70%乙醇溶液轻轻洗涤沉淀2 次。4 ℃、12 000 r/min离心20 min，收集管中沉淀，60 ℃烘箱中烘干；加入10 μL 65 ℃预热的dd H2O重悬连接的载体DNA。将纯化的连接产物的电击转化法转入大肠杆菌E. coli DH5α感受态细胞。取适量培养物涂布于LAXI培养基（100 mg/L Amp、20% IPTG和20 mg/L X-gal），37 ℃培养过夜，即得玉米土壤宏基因组文库。

1.3.3 土壤宏基因组文库β-葡萄糖苷酶的筛选

挑选白色菌落，剔除蓝色菌落，点到β-葡萄糖苷酶筛选培养（100 μg/mL Amp、0.25%柠檬酸铁铵、0.1%七叶苷）平板上，37 ℃培养24 h，观察菌落周围是否有黑色水解圈，有黑色水解圈的菌落为β-葡萄糖苷酶阳性克隆子[20]。

1.3.4 测序及序列的生物信息学分析

1.3.4.1 ORF Finder

挑选转化后仍然具有黑色透明圈的克隆子，提取质粒，EcoRⅠ单酶切，若仍旧能够切出载体和目的DNA条带，则将重组质粒送到Invitrogen公司进行序列测定。将测序得到的目的DNA序列用NCBI的ORF Finder在线工具查找该序列的开放阅读框（open reading frame，ORF），再将ORF序列经pBlast逐一比对，得到序列与已报道的功能蛋白的相似度等信息。

1.3.4.2 系统发育树和氨基酸保守性分析[21-22]

将疑似功能蛋白的基因与已报道的该蛋白各家族成员序列先用Clustal W软件比对序列并导出序列对比结果，再用MEGA 4.0软件中Unrooted Neighbor-Joining Method，the Bootstrap Test选择（1000 replicates）构建系统发育树，得到基因的种属信息和与已报道基因的亲缘关系。

1.3.4.3 等电点、信号肽等性质分析

用在线分析软件ExPASy ProtParam tool（http://web.expasy.org/protparam/）分析氨基酸等电点、半衰期、分子质量、不稳定系数和亲疏水性等。用TMHMM 2.0和SignalP 4.1 servers，分析氨基酸的跨膜区和信号肽序列。用SOPMA预测蛋白的二级结构。

1.3.5 bgl2238基因的PCR扩增与重组菌株的表达

根据测序结果设计一对引物：bgl2238-F和bgl2238-R，引物两端引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点，引物序列如下：bgl2238-fw：5′-CCGGAATTCATGAAAC ACATCCTAAACCTATGCC-3′（下划线部分为EcoRⅠ酶切位点）；bgl2238-rv：5′-CCGCTCGAGTTATCGTACG CTAAAAGTAAGGGCTTC-3′（下划线部分为XhoⅠ酶切位点）。引物由Invitrogen公司合成；以包含pUC118-bgl2238的质粒为模板，采用Prime STARTMMax Premix进行PCR扩增，PCR回收试剂盒对扩增产物进行纯化回收。

分别用XhoⅠ和EcoRⅠ将纯化后的PCR产物和载体pET-32a（＋）进行双酶切，用PCR回收试剂盒纯化双酶切产物，采用T4 DNA Ligase对双酶切处理的pET-32a（＋）及PCR产物16 ℃连接12～16 h，直接转化E. coli BL21（DE3）。随机挑取转化子经培养后，提取其质粒并双酶切验证。挑取酶切验证正确的转化子于37 ℃摇床中培养，当OD值达到0.8左右时，加入IPTG，使其终浓度为1.0 mmol/L，25 ℃诱导表达11 h，收集菌体，超声破碎菌体后得粗酶液。粗酶液采用His·Bind®Resin试剂盒进行纯化。

1.3.6 β-葡萄糖苷酶活力的测定

将重组菌株接种于装有20 mL LB液体培养基中，25 ℃、220 r/min培养11 h，取菌液3 mL，6 000 r/min离心20 min，弃上清液，用冰预冷的无菌dd H2O洗涤沉淀两次，再用4 mL dd H2O重悬细胞沉淀，超声波破碎菌液直至变清，即为粗酶液。取10 μL一定稀释倍数的粗酶液、80 µL最适pH值的B-R缓冲液、50 mmol/L的pNPG 10 µL混合，最适温度下水浴20 min，取200 µL 1 mol/L Na2CO3溶液终止酶促反应，取上述混合物200 µL，测定OD405nm。一个酶活力单位（U）定义为每分钟分解pNPG产生1 µmol pNP所需的酶量。

2 结果与分析

2.1 玉米秸秆还田土壤总DNA的提取及纯化

图1 土壤基因组DNA的琼脂糖电泳分析Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of soil genomic DNA

通过直接提取法获得玉米秸秆还田土壤基因组DNA，结果如图1所示，基因大小片段集中在15 kb以上，大约是23～30 kb之间，拖尾现象不明显，只有极少量DNA被降解，表明直接提取法获得的基因组DNA质量非常好，满足建库的需要。

2.2 土壤宏基因组文库的评估

将扩大酶切后的土壤基因组DNA与载体连接，电击转化入大肠杆菌E. coli DH5α，构建宏基因组文库，随机挑取16 个白色克隆子，EcoRⅠ酶切验证插入片段的大小，有14 个克隆子含有不同插入片段，文库阳性克隆率较高，重组率为87.5%，文库插入片段大小0.8～8.0 kb，该文库含有大约5 500 个阳性克隆子，其插入片段平均长度在4.5 kb左右，片段特异性较好。

2.3 土壤宏基因组文库中β-葡萄糖苷酶的筛选

利用底物七叶苷功能筛选法，对宏基因组文库进行初步筛选，从构建的宏基因组文库5 500 个克隆子中，发现1 个克隆子在七叶苷平板上有黑色水解圈，初步确定其具有β-葡萄糖苷酶活性，编号为44号克隆子，如图2所示。后期通过提质粒、酶切验证后送Invitrogen公司测序。

图 2β-葡萄糖苷酶阳性克隆子的筛选Fig. 2 Screening of positive clones with β-glucosidase activity

2.4 测序及生物信息学分析

2.4.1 NCBI的ORF Finder

将44号克隆子的质粒送交Invitrogen公司进行测序，测序结果显示44号克隆子基因序列全长为2 470 bp。利用NCBI网站中Sequence Analysis的在线查找工具ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）对此序列进行ORF查找，从2 470 bp的插入片段中发现一个β-葡萄糖苷酶编码基因的ORF序列，该ORF基因序列全长2 238 bp，编码745 个氨基酸，基因命名为bgl2238，预测其蛋白分子质量为80.67 kDa，序列已提交至NCBI核酸数据库（GenBank），登录号为KU320675。经NCBI的BlastP在线序列比对分析，发现bgl2238基因序列所编码的蛋白bgl2238含有GH3超家族和GH3C超家族的结构域（图3），其与来源于Bacteroides thetaiotaomicron的β-葡萄糖苷酶（GenBank：WP_048691945.1）具有58%的相似性。

图3 推测的bgl2238的保守序列区域Fig. 3 Putative conserved domains of bgl2238

2.4.2 系统发育树

使用生物信息学软件Clustal W和MEGA 4.0对bgl2238与亲源性较近的蛋白质进行系统发育树的构建，结果如图4所示，可以看出，bgl2238与来源于Alistipes CAG: 435和未培养微生物（登录号：AAZ32298.1）的β-葡萄糖苷酶亲缘关系较近，与其他来源的β-葡萄糖苷酶亲缘关系都较远。

图4 bgl2238与亲缘性较近蛋白的系统发育分析Fig. 4 Phylogenetic analysis of bgl2238

2.4.3 bgl2238的氨基酸序列、二级结构分析

用生物信息学方法预测bgl2238的蛋白分子质量、等电点PI、半衰期、不稳定系数和亲疏水性等基本理化性质、氨基酸跨膜结构域和信号肽序列见表1，信号肽序列分析结果见图5，二级结构见图6。

表1 bgl2238的氨基酸性质分析Table1 Amino acid properties of bgl2238

由表1可知，bgl2238的pI值为4.95，属酸性蛋白质，蛋白结构较稳定，疏水性高，位于细胞膜外且无信号肽序列。

图5 预测的蛋白bgl2238信号肽分析Fig. 5 Signal peptide analysis prediction of protein bgl2238

图6 预测蛋白bgl2238的二级结构Fig. 6 Secondary structure prediction of protein bgl2238

不同的mRNA结构可能编码不同的蛋白质二级结构，翻译慢的mRNA区域倾向于编码β折叠、无规则卷曲结构，翻译快的mRNA区域更倾向于编码α螺旋结构。由图6可知，bgl2238的二级结构中，α螺旋结构占37.05%，无规卷曲结构为49.93%，延伸片层结构占13.02%，说明蛋白bgl2238的mRNA翻译较快。

2.5 bgl2238基因克隆与表达

图7 基因bgl2238的PCR扩增产物Fig. 7 Amplified products of gene bgl2238

以pUC118-bgl2238重组质粒为模板，以bgl2238-F和bgl2238-R为引物进行PCR扩增，得到一条非常明显的DNA条带，大小位于2 000～3 000 bp之间，与预期基因大小2 238 bp一致（图7）。重组质粒pET-32a（＋）-bgl2238直接化转E .coli BL21（DE3）感受态细胞，对重组菌株诱导表达得粗酶液。对粗酶液进行纯化，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，在大约100 kDa处出现了目标条带（图8），与理论计算得到β-葡萄糖苷酶分子质量大小（80.67 kDa）加上分子标签（18.15 kDa）相符合。

图8 bgl2238蛋白纯化SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图Fig. 8 SDS-PAGE analysis of recombinant bgl2238

2.6 β-葡萄糖苷酶bgl2238酶学性质分析

2.6.1 pH值对酶活力及稳定性的影响

图9 pH值对β-葡萄糖苷酶bgl2238活力及稳定性的影响Fig. 9 Effect of pH value on the activity and stability of β-glucosidase bgl2238

保持反应温度为44℃，不同pH值缓冲液中（1.98、2.87、4.10、5.02、6.09、6.59、7.0、7.54、7.96、8.95、9.91、10.88、11.82），测定β-葡萄糖苷酶bgl2238活力，获得一级pH值梯度下的最适pH值范围后，将pH值梯度进一步缩小，以最终获得酶最适反应pH值。将经pH 2.0～12.0缓冲液稀释的粗酶液4 ℃放置4 h后，测定剩余酶活力。将最适pH值下未经4 h孵育的最高酶活力定义为100%。结果如图9所示，bgl2238酶的最适反应pH值为6.10，用pH 6.09～6.59缓冲液处理粗酶液4 h后仍能保持60%以上的酶活力，酶促反应的pH值范围较窄，在偏酸和偏碱性环境下bgl2238的酶活性和稳定性都很低，表明bgl2238属于一种偏中性酶。

2.6.2 温度对酶活力及稳定性的影响

于最适pH值的B-R缓冲液中，分别置于4、15、30、40、45、50、60、70 ℃和80 ℃水浴中进行酶活力测定，获得一级温度梯度下的最适温度范围，再将温度梯度进一步缩小，以获得酶最适反应温度。将适当稀释的粗酶液分别放于4～80 ℃不同水浴中保温4 h，测定剩余酶活力。以未经热处理（4 ℃）的酶液的酶活力定为100%。结果如图10所示，bgl2238酶促反应的最适温度为44 ℃，在32～44 ℃范围内，酶活力随温度的升高而增大，44 ℃后，酶活力随温度上升而急剧下降，至60 ℃时bgl2238完全失活；在4～50 ℃之间不同温度下热处理bgl2238 4 h，发现bgl2238仍保留70%以上的酶活力，表明β-葡萄糖苷酶活力在50 ℃以下稳定性良好。在44 ℃、pH 6.10时bgl2238酶活力最高，计算其酶活力为29.1 U/mg。

图10 温度对β-葡萄糖苷酶bgl2238活力及稳定性的影响Fig. 10 Effect of temperature on the activity and stability of β-glucosidase bgl2238

2.6.3 金属离子对酶活力的影响

在80 μL含金属离子终浓度分别为1 mmol/L或10 mmol/L的最适pH值缓冲液中加入10 μL经稀释的粗酶液，4 ℃放置4 h后，于最适温度条件下测定剩余酶活力。将未加金属离子的酶促反应中酶活力定义为100%。如图11所示，不同浓度的K＋、Na＋、Fe2＋、Mg2＋、Mn2＋、Ca2＋、Co2＋和Ni2＋对酶活力均有促进作用，其中Fe2＋对bgl2238酶活力的促进作用最大，10 mmol/L Fe2＋使相对酶活力高达260%，增加至酶的原始活性的2 倍多，而重金属离子Ag＋、Hg2＋及Cu2＋对酶活力有强烈抑制作用。

图11 金属离子对β-葡萄糖苷酶bgl2238活性的影响Fig. 11 Effect of metal ions on the activity of β-glucosidase bgl2238

2.6.4 β-葡萄糖苷酶bgl2238酶促动力学分析

以pNPG为底物，将粗酶液稀释50 倍，利用Lineweaver-Burk双倒数法测定bgl2238的米氏常数，以1/V为纵坐标、1/[S]为横坐标作图，曲线与x轴相交的点为-1/Km，与y轴相交的点为1/Vmax。结果如图12所示，β-葡萄糖苷酶bgl2238以pNPG为底物时，Vmax=576 μmoL/（L·min），Km= 0.296 mmol/L。

图12 β-葡萄糖苷酶bgl2238以pNPG为底物的动力学参数Fig. 12 Lineweaver-Burk plot for β-glucosidase bgl2238 with pNPG as substrate

3 结 论

宏基因组技术通过基因克隆、序列筛选或者功能筛选法、基因表达等手段，避开了绝大多数微生物难以分离培养的问题，为挖掘新型生物催化剂开辟了新途径[23-29]。本研究筛选到的β-葡萄糖苷酶bgl2238经测定，最适pH值为6.10，用pH 6.09～6.59缓冲液处理粗酶液4 h后仍能保持60%以上的酶活力，表明bgl2238属于一种偏中性酶，在生产过程中只需保持酶促反应的pH值在中性附近即可，对生产设备的酸碱度耐受性要求低，节约成本。β-葡萄糖苷酶bgl2238最适温度为44 ℃，当酶促反应温度升高到50 ℃时，相对酶活力不足40%，说明此酶不耐高温。不同的金属离子影响酶的活性，目前大约35%已知酶在金属离子存在下活性增加[30-31]，金属离子通过与带负电的氨基酸残基结合而增加酶结构的稳定性。本研究中不同浓度的几种金属离子对β-葡萄糖苷酶bgl2238活力均有激活作用，其中Fe2＋对酶活力的促进作用最大，10 mmol/L Fe2＋使相对酶活力高达260%，增加至酶的原始活性的2 倍多，利用β-葡萄糖苷酶bgl2238这一特性，向酶促反应体系中加入适当浓度的K＋、Na＋、Fe2＋可以明显提升bgl2238的酶活力，从而避免某些酶因严重依赖一些金属离子（如Mg2＋、Mn2＋、Cu2＋、Ca2＋、Co2＋、Zn2＋和Ni2＋等）而造成的金属环境污染。为使得bgl2238能够更好、更广泛地应用于工业生产，后期可通过易错PCR对β-葡萄糖苷酶bgl2238进行改造并构建突变文库，以期获得对温度和pH值耐受性更好的酶。

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