表观遗传学调控NK细胞分化及功能的研究进展

张 田， 付 蓉

(天津医科大学总医院血液科， 天津 300052)

表观遗传学(epigenetics)是指在基因核苷酸序列不发生变化的情况下，通过对转录表达的调控和转录后的调控使基因表达发生变化，包括DNA甲基化、组蛋白共价修饰、染色质重塑、基因印记、及非编码RNA、微小RNA(miRNA)、反义RNA转录后调控等[1]。环境、年龄改变、压力、疾病状态等，均可以引起免疫细胞表观遗传学改变，造成免疫系统功能紊乱，导致疾病的发生与进展。因此，表观遗传学逐渐成为免疫学研究的热点。

自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是天然免疫细胞，主要来源于造血干细胞，全身广泛分布。NK细胞通过一系列细胞生物学过程获得激活信号，包括胞外钙离子内流、细胞骨架重排以及与靶细胞接触部位免疫突触形成，最终通过分泌细胞因子、趋化因子及释放毒性颗粒执行清除病毒、肿瘤细胞以及发挥免疫调节功能。NK细胞功能异常导致多种疾病发生，包括感染、肿瘤及自身免疫疾病[2-3]。近年来，有很多学者先后报道了表观遗传学改变对NK细胞增殖、分化及功能的影响，为NK细胞研究提供了新思路，为新药的临床应用奠定了理论基础。本文对NK细胞的表观遗传学研究进展作一综述。

1 表观遗传学对NK细胞分化的影响

人类NK细胞表面特异性表达CD56或CD16分子，根据其表达水平将NK细胞分为CD3-CD56brightCD16-(CD56bright)、CD3-CD56dimCD16+(CD56dim)、CD3-CD56-CD16+3个亚群[4]。其中CD56bright亚群为调节性NK细胞，可以参与适应性免疫调节，通过分泌细胞因子和趋化因子(IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-13和GM-CSF)对树突状细胞(DCs)、调节性T细胞(Tregs)、辅助性T细胞(Ths)及细胞毒性T细胞(CTLs)等进行免疫调控[5]。在类风湿关节炎中，NK细胞可以通过分泌IFN-γ诱导B细胞活化，促进DC细胞成熟，并可抑制T细胞向Th17细胞分化[6]。NK细胞分泌IFN-γ可以促进DC细胞分泌IL-27，而IL-27可促进IFN-γ分泌，这种正反馈参与抑制Th17介导的自身免疫疾病[7]。人和小鼠NK细胞均可通过分泌IFN-γ可以抑制CD4+T细胞向Tregs分化[8]。CD56dim为功能性NK细胞，通过穿孔素/颗粒酶途径、Fas/FasL途径、TNF-а/TNFR-1途径、以及抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)完成对靶细胞的直接杀伤。近期也有研究者发现，功能性NK细胞参与适应性免疫的调节，直接杀伤适应性免疫细胞，如Th17及滤泡辅助性T细胞(Tfh)[9]。而CD3-CD56-CD16+亚群目前研究较少，目前认为主要发挥ADCC作用。

表观遗传学修饰在NK细胞的分化、成熟中发挥了重要作用。早期的研究显示，IL-15受体信号通路对NK细胞的分化成熟至关重要，E4BP4(NFIL3)在其中发挥调节作用，促进了造血干细胞(HSC)向NK细胞分化。动物实验显示，E4BP4基因缺陷小鼠NK细胞减少、功能下降，而过表达E4BP4可增加Id2和Gata3的转录，从而促进HSC向NK细胞分化增加[10]。在NK细胞发育中，组蛋白甲基化也具有重要调控作用。Yin等[11]研究了zeste基因增强子同源物2(EZH2)对早期NK细胞分化的影响。EZH2作为重要的表观遗传修饰酶，是PcG(polycomb group)蛋白家族的重要成员，在调控基因表达的过程中起关键作用[12]。EZH2主要对组蛋白H3K27进行甲基化，从而沉默下游基因，在细胞增殖、分化及肿瘤形成方面都有重要作用[13]。研究者[11]发现，在小鼠及人中，选择性失活EZH2或用小分子抑制其活性后，可以增加IL-15受体(CD122+)阳性的NK祖细胞数量，并促进成熟NK细胞增殖。NK细胞的扩增及杀伤作用还与CD122及NKG2D有关，NKG2D缺失可降低EZH2抑制剂对促进NK细胞增殖及分化的作用。另外，Tsuyama等[14]研究报道，NKT细胞淋巴瘤患者存在组蛋白去甲基化酶KDM6A基因突变，此基因与血液肿瘤关系密切，可能影响NK细胞的增殖。

FcγRIIIA(CD16a)由FCGR3A编码，为 NK细胞在成熟过程中获得。研究发现，在CD16a+细胞中，FCGR3A启动子中转录起始位点的甲基化水平较CD16a-细胞和中性粒细胞明显降低。此外，研究者还发现miR-218是NK细胞CD16a转录后的负调控因子。在NK细胞中过度表达miR-218可降低CD16a的mRNA和蛋白表达水平，miR-218在CD16a-细胞中水平明显高于CD16a+细胞。因此，研究者推断，FCGR3A的转录起始位点甲基化及转录后miR-218的调控作用可以通过改变CD16a的表达来调节NK细胞的分化成熟[15]。

记忆性NK细胞的概念由Sun等[16]最早提出。这类NK细胞可以长期存活，具有免疫记忆功能，当再次接触到“记忆”抗原时被激活。多种病毒可以诱导记忆性NK细胞产生，目前报道的有巨细胞病毒，单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒等[17-18]。记忆性NK细胞表达CD57和NKG2C，不表达FcR、SYK、DAB2、ETA-2、PLZF和ILZF2。FcR、ETA-2、SYK的缺乏均有表观遗传学机制的参与[19-20]。IL-12信号通路通过其下游转录因子信号和转录因子4(STAT4)的激活影响记忆性NK细胞的扩增。Rapp等[21]发现Runx1和Runx3的启动子区域是STAT4的结合位点，在NK细胞活化过程中，STAT4的结合会诱导RUNX基因位点的表观遗传学修饰，从而导致表达增加。在病毒感染中，Runx1和Runx3或它们的伴侣分子表达减低是影响NK细胞扩增及记忆NK细胞形成障碍的原因。该研究证明，STAT4介导的Runx转录因子表观遗传学修饰可以调节NK细胞对病毒的适应行为。

2 表观遗传学对NK细胞功能的影响

NK细胞的功能主要包括杀伤及免疫调节作用。有研究显示，在NK细胞活化过程中，81%的主要位点出现CpG去甲基化，生物学分析显示差异甲基化位点主要集中在免疫调节功能中(如TNFA、LTA、IL-13、CSF2等)[22]，这提示表观遗传学修饰参与了NK细胞的活化，并与NK细胞功能关系密切。

2.1表观遗传学修饰对NK细胞表面受体的调节作用NK细胞表面激活性受体与抑制性受体的相互平衡，在NK细胞功能中发挥了重要调节作用。如激活性受体表达占优，则NK细胞活化，反之，NK细胞处于静止状态。

有学者[23-25]检测了NK细胞免疫球蛋白样受体(KIR)启动子的甲基化水平，结果发现，处于静息状态的人NK细胞92细胞系中KIR2DL1、 KIR2DL2/L3高甲基化，同时，细胞表面的KIR表达降低。当应用5-氮杂胞苷进行去甲基化处理后，KIR启动子去甲基化，NK细胞表面KIR表达明显增加。另外，KIR的表达受miRNA调节。PIWI样RNA可以诱导KIR双向启动子KIR3DL1产生KIR反义转录本，影响双链DNA的合成，可减少90%的KIR表达[25]。

NKG2D是NK细胞激活性受体，其表达增加可增强NK细胞功能。NKG2D通过识别不同的配体家族(MICA、MICB、ULBPs 1-6等)参与激活效应细胞、溶解靶细胞。NKG2D基因在NKG2D+NK细胞中去甲基化，并与组蛋白H3赖氨酸9乙酰化(H3K9Ac)相关。用组蛋白乙酰转移酶(HAT)抑制剂(姜黄素)可以明显下调NKG2D基因H3K9乙酰化水平，进而下调NKG2D的转录，导致NKG2D表达减低，NK细胞杀伤功能下降。此研究提示NKG2D在NK细胞表面表达差异是由表观遗传学机制调节的，并可以通过表观遗传治疗改善[26]。组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸(VPA)通过激活基因启动子中组蛋白K9的高甲基化和DNA甲基化，从而下调NKG2D的表达[27]。同样，miRNA也可发挥对NKG2D的调节作用。在HCV感染患者的NK细胞中，miR-182与对照组相比过表达，miR-182表达升高可降低NKG2D的mRNA水平，而miR-182抑制剂能降低抑制性受体NKG2A的mRNA水平[28]。

2.2表观遗传学修饰对NK细胞细胞因子分泌水平的调节作用NK细胞分泌细胞因子同样受到表观遗传学修饰的调节。Luetke-Eversloh等[29]报道，NK细胞受到刺激后，IFN-γ及T-bet位点转录增加，并发生去甲基化，从而增加IFN-γ的分泌。Li等[30]发现，在NK细胞激活过程中，组蛋白去甲基化酶及甲基转移酶发生明显变化。在NK92细胞系中，与NK细胞激活密切相关的PI3KCA,、NFATC1及TNFSF9等基因，经PMA和依诺霉素刺激可出现H3K4me3和H3K27甲基化修饰，从而调控上述基因表达。采用H3K4和H3K37的特异性抑制剂可以增加NK细胞脱颗粒及IFN-γ 、TNF-α的分泌[22,30]。Cribbs等[31]用染色质甲基化及乙酰化的小分子抑制剂进行筛选，并通过基因敲除方法确定了Jumonli型组蛋白H3K27脱甲基酶是NK细胞分泌细胞因子的关键调节因子。JMJD3/UTX(含有Jumonji结构域的蛋白3)H3K27去甲基化酶抑制剂GSK-J4可引发细胞因子转录起始位点H3K27甲基化，并造成NK细胞IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、IL-10分泌下降。GSK-J4可以明显抑制类风湿性关节炎患者外周血或组织中分离出的NK细胞的细胞因子分泌，抑制破骨细胞形成及骨破坏。除甲基化外，组蛋白乙酰化修饰也对NK细胞细胞因子分泌起调节作用。VPA可抑制NK细胞对白血病细胞的溶解，并且有剂量依赖性。VPA预处理可降低NK细胞IFN-γ分泌，破坏CD107A脱颗粒，并通过激活PD-1/PD-L1途径诱导细胞凋亡[27]。

H3K4me3脱甲基酶KDM5A调节基因转录并参与肿瘤的发生。Zhao等[32]研究证明KDM5A缺陷使IFN-γ产生减少，并损害NK细胞的活化。KDM5A(-/-)小鼠对单核细胞增生李斯特氏菌(LM)感染高度敏感。在NK细胞活化过程中，KDM5A的缺失影响STAT4磷酸化和核定位，并增加了细胞因子信号转导抑制因子1(SOCS1)的表达。进一步研究揭示其机制为KDM5A与P50结合，并与静止NK细胞中的SOCS1启动子区结合，抑制染色质重塑，导致在SOCS1启动子中H3K4me3修饰显著减少。

另外，Lee等[19]在研究记忆性NK细胞时发现，人巨细胞病毒感染后，NK细胞Syk转录起始位点甲基化，Syk基因沉默，可引起表达IFN-γ水平升高。BHLHE40为转录调节因子，在活化的NK细胞中去甲基化，诱导细胞因子分泌(如IL-2、IL-12、IL-15、IFN、TNFA等)，增强NK细胞功能。NFAT转录因子家族通过与启动子及增强子区域结合来增加NK细胞因子的表达。在活化的NK细胞中，NFATC1内含子9 明显去甲基化，可调节NK细胞分泌细胞因子[22]。

3 引起NK细胞表观遗传学变化的因素

多种疾病状态下，NK细胞的表观遗传学修饰会发生变化，如巨细胞病毒感染会激活NK细胞，引起81%的位点发生DNA去甲基化[22]。在儿童哮喘患者中，NK细胞DNA去甲基化，引起NK细胞活性升高[33]。在类风湿关节炎及强制性脊柱炎中，NK细胞均存在表观遗传学改变[31-34]。

一些药物可以引起NK细胞的表观遗传修饰变化。Misale等[35]报道，糖皮质激素可以通过影响H3K27me3来降低IFN-γ的表达，从而抑制NK细胞的免疫功能。5-氮杂胞苷可引起NK细胞DNA去甲基化，诱导相关基因激活，促进NK细胞活化[36]。

运动也可以引起NK细胞表观遗传学修饰发生改变。Zimmer等[37]选取30例非霍奇金淋巴瘤患者及10名健康人，干预组每人每天骑车运动30 min。运动组的患者血清巨噬细胞游走抑制因子(MIF)及IL-6水平升高，NK细胞组蛋白H3、H4乙酰化水平降低。近期，研究者再次证明运动可以通过升高组蛋白乙酰化水平及NKG2D的表达，改善正常人NK细胞活化状态[38]。

压力及年龄的增长对NK细胞的表观遗传学也有明显影响。创伤后应激综合征可以加速NK细胞由年龄造成的甲基化水平升高，从而影响机体免疫状态[39]。

综上所述，表观遗传学修饰影响着NK细胞的增殖、分化、杀伤、免疫调节等，在NK细胞调控中，扮演重要角色。但目前，NK细胞表观遗传学研究多集中在基础实验阶段，在临床疾病中的应用很少。NK细胞参与肿瘤、自身免疫疾病及感染的发病，其异常是否与表观遗传学修饰有关？进一步研究NK细胞表观遗传学异常在疾病发生中的作用，将基础研究向临床应用转化，开拓疾病中NK细胞功能异常的新思路，并为新型药物在临床中的应用提供研究基础，将是本课题组今后努力的方向。