自组装肽纳米纤维支架在骨缺损修复中的研究进展

崔云霞 李保胜 蔡 青 王春阳 王鹤龄 许彤彤 全 旭 孟维艳

随着种植技术的不断发展和完善，种植义齿已成为治疗牙列缺损和缺失的主要修复方式。然而在临床治疗中，由于外伤、炎症、肿瘤和牙周病等原因造成的不同程度的骨缺损，大大缩小了种植义齿的适应症。GBR是临床上常用的骨增量方法，具有较高的成功率，能有效的解决骨量不足的问题[1，2]。近年来，骨替代材料与引导骨再生（GBR）膜的联合应用，在修复骨缺损的临床应用中获得了良好的治疗效果。但现有的骨充填修复材料及屏障膜依然存在着许多不足[3]，难以达到临床骨再生及骨修复的理想要求。寻找一种新型的、更适合的骨缺损修复材料一直是现在的热点研究方向。

现有的骨修复材料主要包括高分子聚合物材料、生物陶瓷材料、金属材料、生物玻璃和复合材料等，但在针对其材料性能进行应用时，各种材料也都有其局限性，如存在机械强度不足、脆性较大、释放金属离子、生物活性差等[4]。研究发现，自组装肽纳米纤维支架（self-assembling peptide nanofiber scaffolds，SAPNS）不仅具有良好的生物活性及可降解性，其对细胞培养和组织修复更具有重要的应用价值。SAPNS作为一种新型的生物可降解材料，在骨组织修复中有良好的应用前景。本文就SAPNS的研究进展和在修复骨缺损的应用中作简要综述。

一、SAPNS的特点及研究进展

1.SAPNS的特点：分子自组装的原理是利用分子与分子或分子中某一片段与另一片段之间相互识别，通过非共价键的弱作用力形成具有特定排列顺序的分子聚合体。这些的弱作用力主要包括氢键，范德华力，静电力和疏水作用力等。利用这一原理，自组装肽通过合理调控多肽分子结构并给予一定的外界刺激（如调节温度、PH和离子强度等），多肽分子可以通过多重非共价键作用，自发或触发地组装形成特异形态与功能的组装体，自行组装成纳米纤维的三维网状结构[5]1993年，科学家发现并在酵母蛋白中提取出具有自组装特性的离子短肽[6]，之后学者们陆续设计出各种新型的自组装肽并广泛应用到组织再生修复中。研究表明，SAPNS这种生物同源的新型生物材料，在细胞培养、药物/基因控制释放、组织工程支架材料等方面有着巨大的应用前景[7]。

在组织再生修复领域，相比于其他材料SAPNS有其卓越的优越性：①其基本结构为氨基酸或多肽，具有良好的生物相容性和生物识别功能[8，9]。②自组装肽纳米纤维支架形成的微环境，与细胞外基质（ECM）具有较高的相似性[10]，有利于细胞的生长和细胞功能的改善。③SAPNS具有生物可降解性[11]，且其降解产物主要是多肽和氨基酸，对周围组织细胞不造成毒性作用。④富含功能化基序（如D型氨基酸，糖肽，功能化肽RAD16，RGD等）的自组装肽纳米纤维材料，可增强细胞的生物识别作用，促进细胞的黏附和分化，提高生物材料的稳定性[12～14]。⑤在药物治疗，再生支架，作为释放细胞因子、生长因子等的载体[15，16]等领域被广泛应用。

2.SAPNS的研究进展：近年来，国内外学者在不同领域对SAPNS都进行了广泛的研究。采用纳米生物技术将表皮生长因子（EGF）结合于自组装肽纳米纤维支架（SAP）材料表面，可以增加创面的上皮化率。其应用于创伤组织的表面覆盖时，局部可以释放生长因子。研究表明含有EGF的SAP支架可加速创面覆盖率约5倍，有利于促进皮肤组织再生修复[17]。另一项研究成果表明：经自组装肽纳米纤维涂层的不锈钢支架可改善其表面的细胞生长的微环境，促进血管内皮细胞的存活与增殖[18]。将分离的神经干细胞在自组装纳米纤维支架上培养后注入到动物脊髓损伤模型，结果显示SAPNS可诱导神经干细胞分化为神经元、胶质细胞和少突胶质细胞，有利于损伤脊髓的再生修复[19]。

随着研究的深入，学者提出不同的设计策略对其进行改性，以期改善和更好的发挥其功能。将含有活性成分序列修饰后的肽或氨基酸制备的纳米纤维材料，在一定的程度上提高了支架材料的生物活性和细胞-界面的相容特性。双亲多肽经离子触发可自组装成为纳米凝胶支架材料，形成与细胞外微环境相似的立体网状结构[20]。G学者等[21]设计了用于角膜组织再生的自组装肽纳米纤维支架系统，即含有特定序列修饰的的双亲性肽（YIGSR-PA）自组装的纳米纤维支架。将人角膜基质细胞在该自组装肽纳米纤维支架上培养，观察结果显示这些细胞保留了它们的原有的特征形态；与对照组细胞相比，增殖分化能力增强。这种含有特定序列的肽自组装的纳米纤维材料可模拟层粘连蛋白功能用于受损的角膜，在支持基质再生和角膜移植方面有巨大的应用潜力。

多肽特定的残端或侧链基团可使其在自组装后具备特定的功能。采用功能基序修饰肽序列，可使肽自组装形成的纳米纤维支架携带具有该生物活性基序的功能，对增强细胞功能有重要作用[22]。例如：肽RADA16-I可以组装成有序纳米纤维和水凝胶，Wu等[14]通过三短肽BMP-7修饰功能化肽RADA16-I制备的三维支架材料RADKPS，在体外能激活退变的髓核细胞，发挥与BMP-7相同的功能特性，有利于提高胶原和蛋白聚糖的分泌表达。该材料还可以诱导BMSC向髓核细胞的分化，在椎间盘损伤的再生治疗领域有较高的应用价值。作为一种新型的组织再生支架，自组装肽纳米纤维支架在各个领域都表现出良好的应用前景。近年来发现，其在骨组织修复方面也具有着巨大的研究价值。

二、自组装纳米纤维支架的成骨作用的研究进展

1.体外研究：研究证实，添加生长因子或设置细胞培养的三维体系，有利于骨髓间充质干细胞的扩增[23]。利用肽纳米纤维支架工的多孔结构和高表面体积比的特殊性质，可以为细胞提供适合的空间和环境支持。用3D自组装肽纳米纤维支架为载体培养骨髓间充质干细胞，表现出较好的生存、粘附、增殖和成骨分化能力[9，24]。在某些肽和蛋白质片段内发现含有RGD序列，加入这些功能片段可用来模拟这些蛋白质的功能。将含有生物活性肽基序（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）修饰RGD肽自组装成的纳米纤维支架包载骨髓间充质干细胞（MSCs）。结果表明，自组装肽纳米纤维材料为MSCs细胞的粘附和多向分化提供了良好的支架，可诱导骨髓间充质干向成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞分化。表明其可能是一种适合于MSCs组织工程的支架，可用于细胞治疗和再生医学[15]。

Ustun等[8]用含有超分子糖胺聚糖样的肽自组装的纳米纤维结构模拟透明质酸（haluronic acid，HA）的功能，并将其与MSCs细胞联合培养，该材料表现出良好的生物相容性能，因其在某种程度上类似天然的透明质酸，可以诱导MSCs细胞向软骨细胞分化。碱性磷酸酶（ALP）与骨传导和骨诱导有关，并可促进羟基磷灰石的沉积。Gulcihan等[25]设计了一种由特定的生物活性肽自组装的纳米纤维，含有磷酸酶样肽的纳米纤维支架（PPA）可模拟天然碱性磷酸酶的催化活性和增强生物矿化的功能，可作用于骨形成并且调节磷的平衡和骨基质的钙化形成。促进成骨样细胞和骨髓间质干细胞向成骨细胞的成熟。陈贝克等[26]将肽RADA16-Ⅰ的C末端与PTHrP（107-111）氨基酸活性末端相接，构建的新型自组装纳米水凝胶，在体外能有效提高成骨前体细胞MC3T3-E1细胞粘附、增殖以及成骨分化能力。

大量的体外研究证实，自组装肽纳米纤维支架材料对细胞有良好的生物相容性且对成骨相关的细胞BMSCs、MC3T3-E1等的增殖、粘附和分化有着良好的促进作用。这些研究成果为进一步将其应用于促进骨修复的体内实验奠定了良好的基础。

2.体内研究：多肽特定的残端或侧链基团可使其在自组装后具备特定的功能，PAs短肽序列在诱导骨组织的生长和矿化有着很大的潜力。含有磷酸丝氨酸残基的两亲性肽（PA）自组装的纳米结构水凝胶材料S（P）-PA和RGS-PA注入到大鼠股骨缺损模型。4周后与植入同种异体骨的大鼠相比取得了类似的成骨效果，可观察到有骨细胞的长入和新的编织骨形成[27]。U学者[8]向兔关节内软骨缺损模型内注入糖胺聚糖样肽自组装成的纳米纤维材料。可能由于含糖肽的纳米纤维对软骨的早期诱导和促进MSCs在缺损部位的粘附作用，12周后缺损处可见新形成的丰富的Ⅱ型组织胶原和基质沉积，材料与缺损部位周围的组织结合密合无脱离。

现如今，尽管金属植入物和表面改性技术在加速骨愈合方面取得了成功，这样的表面还是无法充分吸引在骨整合初期成骨细胞聚集。研究证实，功能性肽修饰和生长因子的控制释放都是增加成骨活性的重要方法[22]。因此，将生长因子或功能性肽用于到植入物表面的生物化学修饰是至关重要的。胶原蛋白模拟肽GFOGER可特异性结合到α2β1整合素受体参与成骨。学者将GFOGER吸附到支架表面合成GFOGER涂层的PCL支架修复大鼠股骨节段型缺损，涂层后的支架可上调成骨细胞分化，进而增加骨形成[28]。骨形态发生蛋白-2（BMP-2）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）是一种有效的骨诱导因子，在骨再生修复过程中起着重要的作用[29]。经分子设计的含有BMP-2自组装肽纳米复合生物材料在大鼠临界股骨缺损模型中可显著增强骨再生，且低剂量的BMP-2即表现出显著的效果[30]。He等[31]将碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）结合D型肽制备的纳米纤维支架（D-RADA16）用于修复大鼠股骨髁缺损，在第8和12周均可观察到缺损处广泛的骨愈合，且骨缺损区骨组织再生量和骨密度增高，载有生长因子bFGF的纳米纤维支架与对照组相比，可进一步促进骨生成。

自组装肽支架是一种水凝胶结构，可以作为骨缺损填充材料。但对于大的骨缺损或承重骨缺损，水凝胶的机械力相对较弱，不能提供足够的机械支撑。因此，有必要将其与其他具有良好机械强度的材料相结合。已经有一些关于基于肽的骨愈合复合支架的研究。例如，肽的两亲物（PAs）水凝胶是用来填补钛合金（Ti-6Al-4V）泡沫孔隙制备混合植骨材料（PA钛合金复合材料）。这种复合材料可促进种植体周围血管生成和骨再生。将其用于治疗SD大鼠后肢股骨干缺损，显示出良好的机械强度和成骨活性[32]。将含序列 KLD12（Ac-KLDLKLDLKLDL-NH2）的肽和P物质制备的纳米纤维（KLD12/KLD12-SP）注入到]聚乳酸/β-磷酸三钙（PLA/b-TCP）多孔支架，并将这种复合支架材料用于修复大鼠颅骨缺损模型，在没有细胞移植的情况下，该复合材料亦能吸附骨髓间充质干细胞至缺损部位，从而加速骨组织的形成。24周观察可见缺损处的骨组织生长，且与周围组织整合良好[33]。

三、问题和展望

良好的骨修复材料应具有良好的机械性能、适当的稳定性以维持骨修复过程中的机械稳定性[34]。自组装肽纳米纤维材料通常呈现的是一种水凝胶的状态[20]，因此作为一种新型骨修复材料，在机械性能方面仍旧表现出许多不足，如抗剪切力、抗压力和韧性较差[4]。因此，如何提高自组装肽纳米材料的生物力学性能仍是一个需要克服和改进的研究热点。有研究表明，自组装纤维网络结构的力学性能受特定分子间相互作用的影响，如离子键交联作用的的纳米纤维较由氢键作用的纳米纤维表现出更强的刚度[35]。因此，我们猜想通过改变其组成的肽和网状纤维之间相互作用的类型来调整材料的刚性和抗变形能力，以改善其机械性能。此外，凝胶状态的自组装肽纳米支架材料或许可用于修复种植体周围的微小型骨缺损、作为抗菌药物的载体用于种植体周围炎的治疗或是作为一种涂层材料应用于金属支架或钛网表面，形成一种复合生物材料，从而提高其生物相容性和成骨效能，为骨修复材料的制备和研究提供新的思路。

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