长链非编码RNA在肾细胞癌中的研究进展

穆中一 裴亮亮 胡滨

肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)是泌尿系统最常见的肿瘤之一，发病率呈逐年上升趋势。约30%的肾癌患者初诊时就已经是转移性肾癌，这类患者手术效果不理想，放化疗及免疫治疗不敏感，靶向治疗短期耐药；对于局限性肾癌，即使积极手术治疗，仍有近三分之一的患者出现转移[1]。结合美国加州大学洛杉矶分校制定的多因素整合分期(UCLA Integrated Staging System, UISS)风险评分系统，低、中、高危组患者的5年生存率分别为90%、62%和42%[2]。因此，对RCC发病分子学机制的探究、寻找早期精确诊断分子标志物以及新的靶向治疗位点显得尤为重要和迫切。近年来，长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)已成为全世界肿瘤分子生物学领域的研究热点，并发现其在多种肿瘤中也扮演着重要的角色，而对其进行进一步研究，有望发现新的与诊治有关的肿瘤分子标志物及新的分子靶向治疗位点，使肿瘤的早期诊断及靶向用药成为可能。本文旨在总结lncRNA在RCC中的最新研究进展，以期为肾癌发病机制的揭示、诊断和治疗提供新的思路。

一、RCC的lncRNA表达谱研究

lncRNA表达谱检测最常用的方法为染色质免疫共沉淀测序和微点阵分析。近年来RCC lncRNA表达谱研究多见，尤其是同时结合了lncRNA表达与其他调控因子的相互作用和lncRNA功能分析的研究。通过lncRNA表达谱的研究，首先发现大量的差异表达的RCC相关lncRNA，若lncRNAs表达明显失调，将进一步通过qRT-PCR进行大样本的验证，并通过功能分析，最终鉴定某些lncRNAs可能作为诊断或预后生物标志物[3-8]。经过系统的lncRNA表达谱的分析，发现大量的lncRNAs的异常表达可能参与肾癌的发生和发展，也发现某些lncRNAs可能作为合适的诊断和预后标志物。lncRNA表达谱的研究可为进一步揭示RCC发生、发展的分子机制及发现新型的特异性高、敏感性好的生物标志物提供重要的理论依据。

二、血浆lncRNA作为RCC的诊断标志物

相对于其他RNA，lncRNA更具器官和肿瘤特异性，因此lncRNA能提供更精确的诊断信息[9]。肾透明细胞癌(clear-cell renal cell carcinoma, ccRCC)和正常肾组织中lncRNA表达谱已确定，这为区分癌症和正常肾组织提供了精确的信息。因此，RCC患者的循环lncRNA可应用于液体活检中，用于寻找新的RCC诊断标志物[5,10-11]。近来，Wu等[12]评估了循环lncRNAs是否可作为诊断ccRCC的标志物。他们利用qRT-PCR法分析了71例ccRCC患者及健康对照者的肾组织和血清中82种癌相关lncRNAs，最终发现5个lncRNA组合(lncRNA-LET、PVT1、PANDAR、PTENP1、linc00963)可能用于ccRCC的诊断。

三、lncRNA作为RCC的预后标志物和治疗靶点

1.细胞黏附分子1-反义序列1(cell adhesion molecule 1-antisense sequence 1, CADM1-AS1)：CADM1-AS1是位于11号染色体细胞黏附分子1的反义lncRNA。Yao等[13]报道，ccRCC组织中CADM1-AS1的表达较对照组显著下调；抑制CADM1-AS1表达可显著促进RCC细胞的生长、迁移，并抑制其凋亡；CADM1-AS1表达降低与ccRCC患者临床进展和不良预后呈正相关；此外，他们发现CADM1-AS1下调是评估ccRCC预后的一个独立风险因素。以上表明，CADM1-AS1可能在ccRCC的发展和演进中发挥重要的作用，有望成为ccRCC理想的治疗靶点。

2.肾细胞癌相关转录因子1(renal cell carcinoma-related transcript 1, RCCRT1)：RCCRT1位于染色体5:137801181-137805004上，因在RCC中被首次发现而得此名。Song等[14]报道，RCCRT1在RCC组织中显著高表达，且其高表达与RCC患者的肿瘤大小、分期、分级及转移呈正相关；另外发现，RCCRT1高表达的RCC患者更易出现淋巴结或远处转移；体外细胞实验发现，干扰RCCRT1的表达后RCC的细胞侵袭、迁移能力均显著降低。以上表明RCCRT1在RCC发生和进展中发挥重要作用，有望成为预测RCC恶性程度及生存的生物标志物和RCC理想的治疗靶点。

3.Sprouty同源基因4-内含子转录本1(sprouty homolog 4-intronic transcript 1, SPRY4-IT1)：SPRY4-IT1位于染色体5q31.3上，由SPRY4基因一个内含子转录而来，长度为703 bp,最初在脂肪组织中发现。SPRY4-IT1在多种肿瘤中异常表达并扮演着重要角色[15-16]。Zhang等[17]研究发现，SPRY4-IT1在RCC组织和细胞系中显著高表达,SPRY4-IT1异常高表达与RCC患者的组织学分级、TNM分期、淋巴结和远处转移呈正相关；另外，RCC细胞中干扰SPRY4-IT1表达可显著抑制RCC的细胞增殖、迁移和侵袭能力。提示SPRY4-IT1可能是RCC患者预后不良因素，并有望成为RCC精准靶向治疗的理想靶点。

4.肺腺癌转移相关转录因子1(metastasis associated in lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT1)：MALAT1定位于染色体11q13上，首次在非小细胞肺癌中被发现。近来发现MALAT1在多种肿瘤中表达上调[18-20]。Zhang等[21]研究发现，MALAT1在ccRCC组织和细胞系中显著高表达，且其高表达与ccRCC患者肿瘤大小、肿瘤分期和淋巴结转移呈正相关，高表达MALAT1的ccRCC患者总生存时间明显缩短，且MALAT1高表达是ccRCC患者独立的预后因素；体外细胞水平研究发现，干扰MALAT1可显著抑制RCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力。Hirata等[22]发现MALAT1在RCC组织中表达显著升高，MALAT1高表达可促进RCC中EZH2表达和上皮-间质转化；此外RCC中MALAT1作为miR-205的竞争性RNA，促进RCC发生进展。Xiao等[23]进一步发现，在RCC中，MALAT1可吸附miR-200s作为竞争性内源性RNA来促进ZEB2的表达，发挥其促进RCC发生进展的作用。Chen等[24]的研究发现MALAT1通过上调Livin表达进而发挥促进RCC细胞增殖和转移作用。以上研究表明，MALAT1有望成为RCC理想的预后标志物及治疗靶点。

5.H19：H19定位于胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2, IGF2)下游的200 kb范围内，靠近染色体11p15.5端粒区，可与IGF2基因构成交互印记基因。H19序列高度保守，主要位于细胞质内。研究表明H19在多种肿瘤中表达上调，且已成为基因靶向治疗的靶点，并已被成功用于临床试验[25-26]。Wang等[27]研究发现，H19在RCC组织和细胞系中的表达均上调，且H19高表达与肿瘤分期、转移呈正相关；体外细胞功能实验研究发现，干扰H19表达可以抑制RCC细胞增殖、迁移和侵袭能力，并促进其凋亡。He等[28]研究发现，H19通过吸附miR-29a-3p调控E2F1表达进而发挥促进RCC发生、发展的作用。以上表明，H19有望成为RCC基因靶向治疗的靶点。

6.母源性印记基因3(maternally expressed gene 3, MEG3)：MEG3定位于人类染色体14q32.3上，与DLK1基因构成DLK1-MEG3印记基因，长度为35 kb。近来研究发现，MEG3在多种肿瘤中发挥重要作用[29-30]。Wang等[31]研究发现，MEG3在RCC组织和细胞株中均显著低表达；体外实验研究发现，MEG3过表达可促进RCC细胞凋亡，增加胱冬酶9蛋白的表达，降低B淋巴细胞瘤-2表达，促进细胞色素c向细胞质的转移。表明MEG3可能通过激活线粒体途径进而促进RCC细胞凋亡。以上研究表明，MEG3可能成为RCC靶向治疗的潜在靶点。

7.神经母细胞瘤相关转录物1(neuroblastoma-associated transcript-1, NBAT-1)：NBAT-1定位于染色体6p22上，最初在神经母细胞瘤中被发现而得名[32]。Xue等[33]研究发现，NBAT-1在RCC组织和细胞系中的表达显著降低,其低表达与RCC患者组织学分级、TNM分期、淋巴结转移及总体生存呈负相关；细胞实验表明，干扰NBAT-1表达后，RCC细胞增殖、迁移和侵袭能力显著增强；NBAT-1表达水平是RCC患者的独立预后因素。表明，NBAT-1有望成为RCC理想的预后标志物和治疗靶点。

8.HOX转录反义RNA(HOX transcript antisense RNA, HOTAIR)：HOTAIR位于染色体12q13,属于基因间lncRNA，长度为2 158 bp[34]。大量研究表明，HOTAIR表达异常上调在多种肿瘤中发挥重要的作用[35-36]。Wu等[37]研究发现，HOTAIR在RCC组织及细胞系中表达均上调；功能实验中发现，抑制HOTAIR表达可显著降低RCC细胞的增殖能力，显著促进其凋亡，并抑制细胞迁移和侵袭能力。另外，Chiyomaru等[34]研究发现，miRNA-141具有抑制RCC细胞增殖和侵袭的能力；HOTAIR在RCC细胞中显著高表达，并与miRNA-141的表达呈负相关；进一步发现，miRNA-141可特异性与HOTAIR结合并抑制HOTAIR表达，降低RCC细胞增殖及侵袭的能力。Hu等[38]研究发现，HOTAIR可通过与SAV1蛋白直接作用，下调SAV1表达，增加组氨酸H3K27甲基化，进而激活Hippo通路，发挥促进RCC的发生、发展作用。Hong等[39]发现，HOTAIR通过抑制miR-217调控HIF-1α/AXL信号，进而发挥促进RCC发生、发展的作用。以上表明，HOTAIR参与RCC的发生、发展，可能为RCC靶向治疗提供一个新的靶点。

9.生长停滞特异性转录本5(growth arrest-specific transcript 5, GAS5)：GAS5位于人类染色体1q25.1，长度为4 983 bp，最初作为生长停滞细胞中高表达的基因被发现而得其名。Qiao等[40]研究发现ccRCC组织中GAS5的表达显著降低，ccRCC细胞株中GAS5过表达后细胞增殖能力明显降低，凋亡率明显增加，细胞迁移和侵袭能力明显降低，表明GAS5是RCC的抑癌基因之一，可为治疗RCC提供一个新的治疗靶点。

10.浆细胞瘤变异易位1(plasmacytomavarianttranslocation 1, PVT1)：PVT1是一个1 957 bp的线性lncRNA，含有9个外显子，位于8q24.21。Bao等[41]研究发现，PVT1在ccRCC组织中表达上调；PVT1高表达与患者性别、肿瘤大小、pT分期、TNM分期、Fuhrman分级呈正相关；PVT1高表达与患者无病生存期和总生存期缩短呈正相关，PVT1为ccRCC独立的预后因素。Wu等[42]利用TCGA数据分析发现，PVT1在ccRCC中表达上调；PVT1高表达与患者TNM分期、组织分级及不良预后呈正相关；体内外实验进一步证实，PVT1可通过调控Mcl-1的表达抑制RCC细胞的凋亡促进其增殖。Yang等[43]研究发现，PVT1在ccRCC中显著高表达，其高表达与患者的不良预后相关；PVT1通过吸附miR-200s进而调控BMI1、ZEB1和ZEB2表达发挥促进ccRCC发生、发展的作用。以上结果表明，PVT1有望成为RCC预后的标志物和理想的治疗靶点。

11.尿路上皮癌抗原1(urothelial cancer associated 1, UCA1)：UCA1是一种新型lncRNA，属于内源性逆转录病毒家族成员之一。UCA1自从受精卵开始出现高表达，胚胎期表达于各种器官中，但是在成体中只是表达于心脏、脾和胎盘中。Li等[44]发现UCA1在RCC组织和细胞中表达显著增加，干扰UCA1后RCC细胞增殖和迁移能力降低，凋亡增加。Wang等[45]利用TCGA数据库和临床RCC标本分析发现UCA1在RCC中表达增加，UCA1高表达与男性患者、野生型PBRM1和BAP1突变相关。Lu等[46]研究发现UCA1通过调控EZH2和miR-495促进RCC进展。

12.核富集转本1(nuclear-enriched abundant transcript 1, NEAT1)：NEAT1是一种新发现的lncRNA，其通过在细胞核中调节基因编辑来调节基因表达。Ning等[47]发现NEAT1在ccRCC组织中异常高表达，且其高表达与患者的肿瘤大小、Fuhrman分级、淋巴结转移及不良预后呈正相关；干扰NEAT1可抑制细胞增殖、侵袭和迁移，诱导细胞凋亡。Liu等[48]研究发现，NEAT1可通过调控miR-34a/c-Met轴增强RCC上皮间质转化和化疗耐药。以上结果表明，NEAT1有望成为RCC预后的标志物和理想的治疗靶点。

13.其他lncRNA：通过TCGA、GEO大数据分析、下一代基因测序、实时定量PCR等生物学技术对比分析RCC和癌旁组织标本中lncRNA的差异性，结合患者肿瘤大小、TNM分期、分级及预后等信息，并通过细胞和动物模型验证等研究，最近发现多种与RCC预后相关并可能成为潜在的RCC治疗靶点的lncRNA还包含lncRNA GIHCG、lncRNA LUCAT1、lncRNA SNHG14、lncRNA RP11-436H11.5、lncRNA ROR、 lncRNA FILNC1等[49]。但其特异性、敏感性尚需要进一步的多中心、大样本实验验证，这些lncRNA与RCC的关系及具体调控方式也还有待深入分析和挖掘。

四、lncRNA作为RCC靶向药物耐药的标志物

靶向药物应用于治疗RCC已10余年，约有15%的患者先天性耐药，其他患者在治疗半年到1年内出现耐药及疾病进展[50]。最近，研究人员利用lncRNA微阵列、生物信息学分析、经典分子生物学技术、体内外过表达和干扰等实验方法，分别在临床样本、细胞水平及动物水平对lncRNA在RCC靶向治疗药物耐药中的作用机制进行了系统研究，并获得重大的发现。Qu等[51]对RCC靶向治疗药物索坦(舒尼替尼)耐药相关的lncRNA进行了筛选以进一步验证其临床意义，他们首先通过RCC临床样本、患者移植瘤样本，利用RNA干扰功能实验筛选出一条在RCC耐药细胞中高表达且有功能的lncRNA，称之为lncARSR；进一步研究发现肿瘤组织及血浆中lncARSR高表达的RCC患者对舒尼替尼的治疗反应性差，而lncARSR低表达的RCC患者对舒尼替尼的治疗反应性较好。这提示我们，lncARSR可作为RCC靶向治疗药物舒尼替尼耐药的潜在靶点，也可作为预测舒尼替尼治疗RCC患者敏感性的标志物。Xu等[52]进行了索拉非尼耐药相关的lncRNA研究，他们通过临床RCC RNA芯片，对索拉非尼治疗有效和无效的RCC患者进行对比，筛选出与RCC索拉非尼原发性耐药相关的lncRNA，称之为lncSRLR；利用与lncARSR相似的实验方法，他们发现lncSRLR在临床索拉非尼耐药样本中和索拉非尼耐药的RCC细胞系中均高表达，抑制lncSRLR可以增加RCC细胞对索拉非尼的敏感性，增加lncSRLR表达可使RCC细胞系对索拉非尼的耐药性增加。小鼠体内实验进一步发现，增加lncSRLR表达可使移植瘤对索拉非尼的反应性减弱。

五、问题与展望

RCC与其他恶性肿瘤的发生、发展过程相似，也是一个多因素和多环节联合作用的结果，揭示RCC发病机制及寻找新的分子标志物和治疗靶基因的研究一直都是RCC研究的热点。目前关于RCC的研究已经深入基因水平，而lncRNA的发现是基因遗传学又一重要的补充，且发现lncRNA在基因表达调控中作用机制广泛、作用模式独特，lncRNA的相关研究已经成为RCC研究领域的热点。但由于lncRNA种类多、数量大，调控机制复杂多样，而研究手段仅停留在用研究编码蛋白功能基因及miRNA等的类似方法上，因此，目前对lncRNA与RCC关系及具体调控网络的认识还不够深入，还有待于进一步研究。但随着生物医学的不断发展、技术的革新，lncRNA在RCC中的作用机制将会逐步揭开，lncRNA将为寻找RCC早期诊断的分子标志物、研发新型靶向药物治疗位点和协助临床医生判断患者的预后奠定全新的理论基础。