Au@Ag纳米粒子表面增强拉曼光谱法高灵敏检测孔雀石绿

王利华，王佳慧，韩艳云，朱运峰，吴文辉，肖康飞，战艺芳，曾令文

武汉市农业科学院环境与安全研究所，湖北 武汉 430074

孔雀石绿（malachite green，MG），结构式见图1，是一种人工合成的三苯甲烷类有机化合物，既是染料也是细菌、真菌等的优质杀菌剂［1］。因其对水产类鱼虾体水霉病、鱼卵水霉病以及鳃霉病等细菌性疾病有良好的防治效果，20世纪30年代起就被广泛用于渔业生产［2］。MG加入养殖水中后，容易被鱼、虾等吸收并代谢为无色MG，两者均具有较高毒性和致癌性［3-4］。因此，自20世纪90年代开始，世界上许多国家相继禁止其在可食用的水产类养殖中使用。我国于2002年也将MG列入了《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》，并明确禁止其用于所有食用动物的养殖［5］。尽管如此，由于MG杀菌的高效性、廉价性，且暂时没有其他理想的替代药物，目前一些不法渔民仍将其用于水产养殖中，这种不法行为势必对人们的生命健康造成重大隐患。因此，在水产类产品流入市场之前，有必要进行MG检测。

图1 孔雀石绿盐酸盐的结构式Fig.1 Structure of malachite green hydrochloride

MG传统的检测方法主要有液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、气相色谱-质谱联用法等［6-7］。尽管这些方法灵敏度高、准确度高，但均需要大型昂贵的仪器、专业的操作人员以及复杂的样品前处理等，检测时间长，无法满足水产类产品日益增长的现场快速筛查需求。表面增强拉曼光谱技术（surface enhanced Raman scattering，SERS）作为一种新兴的指纹光谱式检测技术，具有灵敏度高、特异性好、检测快速、操作简便且可实现无损检测的特点，在食品安全快检领域越来越受到重视［8-10］，它是现有快检方法中最有可能实现“傻瓜式”检测的技术之一。近年来，基于SERS技术的MG现场检测方法已有相关报道。例如，顾振华等［11］基于纳米金和便携式拉曼光谱仪发展了一种养殖水中孔雀石绿快速检测方法。尽管该方法简单、快速，但灵敏度不够高，检测限为5.0 μg/L。众所周知，SERS技术最核心的内容是制备均一性好、增强效果好的金/银纳米材料充当增强基底实现待测对象的高灵敏检测。在金/银纳米材料中，尽管纳米金具有良好的稳定性，但其增强效果明显劣于银纳米材料；而单纯的银纳米材料在空气中又易氧化［12］。因此，考虑到银包金材料不仅具有良好的稳定性且增强效果非常好，本文通过晶种增长-抗坏血酸室温还原法合成了Au@Ag纳米材料，并以此为基底，采用SERS技术，成功构建了一种基于便携式拉曼光谱仪的MG现场快速高灵敏检测方法，实际可实现的检测限低至0.5 μg/L。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

紫外可见吸收光谱（ultraviolet-visible absorption spectrum，UV-vis）在 UV 分光光度计（Shimadzu，UV-2600）上采集。样品的透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）图在FEI Tecnai G2 20透射电子显微镜（TWIN，Japan）上测定。样品的SERS光谱在海洋光学亚洲分公司生产的便携式拉曼光谱仪Accuman SR-510 Pro上采集，其所用的激光光源波长为（785±0.5）nm，功率350 mW。对于每一个样品，均在基底的不同位置至少采集3个SERS光谱，然后取平均值。

氯金酸购自上海九鼎化学科技有限公司，抗坏血酸（质量分数为99%～100.5%）、柠檬酸钠和柠檬酸（质量分数为99%）购自美国Sigma-Aldrich公司，硝酸银购自中国上海试剂一厂，MG购自苏州快捷康生物技术有限公司，结晶紫（crystal violet，CV）购自国药集团化学试剂有限公司。所有其它试剂均为分析纯或更高纯度，且使用前未进一步处理。实验用水为Milli-Q超纯水（阻值大于18.2 MΩ·cm），基围虾购自武汉市白沙洲大市场。

1.2 纳米金的合成

纳米金的合成参照文献［13］采用两步增长法合成。首先，合成增长所需的晶种。典型的过程如下：在烧瓶中，加入 2.5 mL HAuCl4·3H2O（质量浓度为2 g/L）溶液，稀释至50 mL，剧烈搅拌，加热至沸腾后，快速加入2 mL柠檬酸钠-柠檬酸混合溶液（其质量浓度分别为10 g/L和5 g/L）。继续加热搅拌5 min，冷却至室温备用。

第一步增长：取3 mL晶种稀释至20 mL，室温下剧烈搅拌，将溶液A和B同时缓慢加入烧瓶中；之后在油浴条件下加热至沸腾，继续搅拌30 min，最后冷却至室温。

第二步增长：取4.5 mL第一步增长获得的溶液稀释至20 mL，室温下剧烈搅拌，将溶液A和B分别同时缓慢加入烧瓶中；之后在油浴中加热至沸腾，继续搅拌30 min，最后冷却至室温备用。

以上两步增长中溶液A和溶液B的配制：

溶液A：2 mL HAuCl4·3H2O（质量浓度为2 g/L）溶液用水稀释至10 mL；

溶液B：0.5 mL抗坏血酸和0.25 mL柠檬酸钠（其质量浓度均为10 g/L）混合用水稀释至10 mL。

1.3 Au@Ag纳米颗粒的合成

Au@Ag纳米颗粒的合成参照文献［14］进行。典型的合成过程如下：在5 μL纳米金溶液中依次加入200 mL柠檬酸钠溶液（38.8 mmol/L）、50 μL抗坏血酸溶液（0.1 mol/L），室温剧烈搅拌下缓慢加入200 μL硝酸银溶液（0.01 mol/L），持续剧烈搅拌约15 min后，将产物保存在4oC冰箱中备用。

1.4 MG标准品以及实际样的SERS检测

MG标准溶液的配制：准确称取1.0 mg MG标准品粉末溶于1 mL乙腈中，制得1 g/L标准溶液。然后用水依次稀释不同倍数，分别配制100 μg/L、50 μg/L、10 μg/L、5 μg/L、3 μg/L、2 μg/L、1 μg/L的MG标准溶液。

MG标准品的SERS检测：200 μL Au@Ag纳米粒子溶液中，依次加入30 μL助剂H（NaCl和KBr的混合溶液），200 μL待测标准溶液，混匀后进行SERS测试。采集频率为5 s 5次。CV标准溶液的测试与MG类似，只需将MG标准品换成CV标准品即可。

MG实际样检测：首先，将菜市场购买的基围虾虾肉在国标的基础上稍加改变进行相关的前处理，直接检测时并未检出。随后将处理后获得的溶液用作基质，向其中加入MG的标准溶液，配成模拟样本进行检测。具体测试过程与标准品类似。

2 结果与讨论

2.1 纳米金和Au@Ag纳米粒子的表征

首先，对纳米金的合成过程进行了UV-vis表征。如图2（a）所示，初始合成的晶种颗粒在518.5 nm处有最大吸收峰，其可归属为纳米金的表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）峰。随着HAuCl4溶液的加入，逐步增长后，该峰依次红移至520 nm和535 nm。对二次增长合成的金颗粒进一步进行TEM表征发现，此时的金颗粒为球形，且分散性较好、粒径较均一，如图2（a）中的插图所示。由于Au@Ag纳米粒子的SERS增强效果明显优于纳米金［12］，以二次增长合成的金纳米颗粒为种子，进一步合成了Au@Ag纳米粒子。从图2（b）中UV-vis可以看出，相对金纳米颗粒而言，此时的Au@Ag纳米粒子在402 nm和521 nm处有两个最大吸收峰，其分别归属为Au@Ag纳米粒子中银壳和金核的SPR峰。Au@Ag钠米粒子的TEM结果表明，因银壳的包裹，此时粒子的粒径相对增大，约100 nm，如图2（b）中的插图所示。

图2 （a）纳米金和（b）Au@Ag纳米粒子的UV-vis和TEM图Fig.2 UV-vis and TEM images of（a）Au nanoparticles and（b）Au@Ag nanoparticles

2.2 MG的表面增强拉曼光谱图

用SERS技术对10 μg/L MG的可行性检测进行了验证。如图3所示，Au@Ag纳米粒子及Au@Ag纳米颗粒-助剂H的混合溶液均没有明显拉曼峰。当10μg/LMG标准溶液加入后，在438cm-1、1170cm-1、1 617 cm-1处均显示出MG的特征峰，这与文献［15-16］报道一致，可作为MG定性检测的依据。

图3 不同溶液的SERS图Fig.3 SERS spectra of different solutions

2.3 MG检测条件的优化

为提高MG检测的灵敏度，本文对测试过程中Au@Ag纳米粒子中银层厚度、Au@Ag纳米粒子的体积、助剂H的体积以及MG样品的加样顺序进行了优化，该优化过程均以3 μg/L MG在1 617 cm-1处峰作为参考（见图4中虚线框）。

由于不同银层厚度的Au@Ag纳米粒子增强效果不一样，通过固定Au@Ag纳米粒子合成过程中纳米金的粒径以及改变AgNO3加入的量，首先对Au@Ag纳米粒子的银层厚度进行了优化。如图4（a）所示，随着AgNO3体积的增加，Au@Ag纳米粒子中银壳逐渐变厚，SERS增强效果逐渐明显；当AgNO3体积增加至 200 μL时，1 617 cm-1处峰强达到最大；而当AgNO3体积继续增加时，形成的Au@Ag纳米粒子溶液变得更加浑浊且容易聚沉，增强效果有下降的趋势。因此，选取AgNO3的最佳体积为200 μL。

接着，对增强试剂的量进行了优化。如图4（b）所示，随着Au@Ag纳米粒子体积的增加，MG在1 617 cm-1处峰强逐渐增大；当体积增加至200 μL时，峰强达到最大值；继续增加体积，增强效果有下降的趋势。该现象表明，Au@Ag纳米粒子的体积为200 μL时，MG在其表面的单分子层吸附已达到最大值。因此，选取Au@Ag纳米粒子的最佳体积为200 μL。

本文中助剂H为NaCl和KBr的混合溶液，其加入Au@Ag纳米粒子溶胶中后会导致纳米颗粒发生聚集，使其局域等离子电磁场发生变化，继而在纳米颗粒间产生许多“热点”［17］。当MG分子处于这些“热点”位置时，其拉曼信号会得到极大增强。其中，纳米颗粒聚集程度的高低直接影响“热点”的数量以及溶胶的沉降速度；而聚集过程中处于“热点”位置的MG分子数进一步影响其拉曼信号的放大倍数，最终影响其检测灵敏度。基于此，本文进一步对助剂H的体积进行了优化。从图4（c）可以看出，随着助剂H体积的增加，1 617 cm-1处峰强逐渐增大；当体积增加至30 μL时，峰强达到最大值；继续增加体积，增强效果逐步下降，当体积增加至80 μL时，1 617 cm-1处峰几乎消失。该现象表明，当助剂H体积为30 μL时，处于“热点”位置的MG分子达到最大值，此时再增加助剂体积，导致Au@Ag纳米颗粒聚集速度过快，很快下沉到检测器皿底部，MG分子难以顺利到达“热点”位置，反而会影响MG拉曼信号的放大，起不到增强效果。因此，选取助剂H的最佳体积为30 μL。

图4 检测条件优化：（a）不同体积AgNO3对应的Au@Ag纳米粒子；（b）Au@Ag纳米粒子溶液体积；（c）助剂H体积；（d）加样顺序（体积单位：mL）Fig.4 Optimized test conditions：（a）Au@Ag nanoparticles with different volumes of AgNO3；（b）Volumes of Au@Ag nanoparticles；（c）Volumes of auxiliary H；（d）Order of sample added

最后，对检测过程中的加样顺序进行了优化。如图4（d）所示，当待测液在助剂H之后加入时，1 617 cm-1处峰强明显增大。这可能因为助剂中的卤素离子优先吸附到Au@Ag纳米粒子表面［18］，当待测液加入时，更有利于促进MG分子吸附到Au@Ag纳米粒子表面，从而使增强效果变得更强。因此，选用增强试剂、助剂H、待测液为测试时的最佳加样顺序。

2.4 灵敏度实验

基于上述实验获得的优化条件，本文进一步考察了该方法检测MG的灵敏度情况。如图5（a）所示，随着MG质量浓度的增加，其在1 617 cm-1处的特征峰逐渐增强。当MG质量浓度为0.5 μg/L时，其在 438 cm-1、1 170 cm-1、1 617 cm-1处的特征峰仍明显可见。该方法最终检测MG的线性范围为0.5 μg/L～10 μg/L（R2=0.991），如图 5（b）所示，实际可检测到的最低浓度为0.5 μg/L，优于现有基于便携式拉曼光谱仪的相关文献报道（例如，顾振华等［11］检测养殖水中孔雀石绿检测限为 5 μg/L、李春颖等［19］检测孔雀石绿标准品检测限为0.8 μg/L），表明该方法检测MG灵敏度很高。

此外，CV与MG具有类似的杀菌作用，常被一起用于水产养殖中［20-21］。因此，本文尝试用该方法对CV进行测试。从图6（a）可以看出，该方法对1 μg/L CV具有非常好的测试效果，其在802 cm-1、941 cm-1、1 170 cm-1、1 620 cm-1处的特征峰信号非常明显［14］。

2.5 实际样测试

将基围虾虾肉进行前处理，与增强试剂Au@Ag纳米粒子以及助剂H混合后，直接进行SERS检测，未检出MG。为测试该方法在实际样本中的检测能力，以虾肉前处理获得的溶液作为基质，配制10 μg/L和20 μg/L的MG模拟样本溶液进行测试。如图6（b）所示，由于提取液中非组分（如小分子蛋白质）的干扰，拉曼谱图中荧光背景增强明显，拉曼峰强度较同浓度标准品有明显下降。尽管如此，模拟样本中MG质量浓度为10 μg/L时，其特征峰仍较好分辨。该结果表明，作为一种快速定性检测方式，该方法有望应用于实际样品的检测中。

图5 （a）不同浓度MG的SERS图；（b）工作曲线（质量浓度单位：μg/L）Fig.5 （a）SERS spectra of Au@Ag nanoparticles with different MG mass concentrations；（b）Working curve

图6 （a）1 μg/L CV的SERS图；（b）MG模拟样本的SERS图Fig.6 （a）SERS spectrum of CV with 1 μg/L；（b）SERS spectra of artificial MG samples

3 结 语

本文采用晶种增长法合成粒径较均一、分散性良好的纳米金，并以此为种子进一步合成了Au@Ag纳米粒子。基于该材料优良的SERS增强效果以及便携式拉曼光谱仪，成功构建了一种简单、快速、高灵敏的MG的现场定性检测方法，对MG标准品可以实现低至0.5 μg/L的检测。进一步的实际样测试表明，该方法有望用于鱼肉、虾肉等水产品组织样本中MG的现场快速筛查，对保障人们舌尖上的安全具有重要的意义。

［1］ 邱绪建，林洪，江洁.渔药MG及关联化合物检测方法研究进展［J］. 海洋水产研究，2005，26（2）：92-96.

［2］ 王群，宋怿，马兵.水产品中MG的风险评估（一）［J］.中国渔业质量与标准，2011，1（2）：38-43.

［3］ SRIVASTAVA S，SINHA R，ROY D.Toxicological effects of malachite green ［J］.Aquatic Toxicology，2004，66（3）：319-329.

［4］ CULP S J，BLANKENSHIP L R，KUSEWITT D F，et al.Toxicity and metabolism of malachite green and leucomalachite green during short-term feeding to Fischer 344 rats and B6C3F1mice ［J］.Chemico-Biological Interactions，1999，122（3）：153-170.

［5］ 王玉堂.禁用渔药化合物及其危害［J］.中国水产，2017（1）：76-80.

［6］ CHEN G Y，MIAO S.HPLC determination and MS confirmation of malachite green，gentian violet，and their leuco metabolite residues in channel catfish muscle［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58（12）：7109-7114.

［7］ 李永夫，高华鹏，姚芳，等.高效液相色谱法检测鳗鱼中MG及其代谢物残留［J］.安徽农业科学，2009，37（1）：31-33.

［8］ HUANG J，CHEN F，ZHANG Q，et al.3D silver nanoparticles decorated zinc oxide/silicon heterostructured nanomace arrays as high-performance surface enhanced Raman scattering substrates ［J］.ACS Applied Material&Interfaces，2015，7（10）：5725-5735.

［9］ WANG P，WU L，LU Z C，et al.Gecko-inspired nanotentacle surface-enhanced Raman spectroscopy substrate for sampling and reliable detection of pesticide residues in fruits and vegetables ［J］. Analytical Chemistry，2017，89（4）：2424-2431.

［10］ WANG J F，WU X Z，WANG C W，et al.Facile synthesis of Au-coated magnetic nanoparticles and their application in bacteria detection via a SERS method ［J］.ACS Applied Material&Interfaces，2016，8（31）：19958-19967.

［11］ 顾振华，赵宇翔，吴卫平，等.表面增强拉曼光谱法快速检测水产品中的孔雀石绿［J］.化学世界，2011，52（1）：14-16，22.

［12］ SHEN A G，CHEN L F，XIE W，et al.Triplex Au-Ag-C core-shell nanoparticles as a novel Raman label［J］.Advanced Functional Materials，2010，20（6）：969-975.

［13］ ZIEGLER C，EYCHMÜLLER A.Seededgrowth synthesis of uniform gold nanoparticles with diameters of 15-300 nm［J］.The Journal of Physical Chemistry C，2011，115（11）：4502-4506.

［14］ WANG L H，SHEN A G，LI X C，et al.Inclusion of guest materials in aqueous coordination network shells spontaneously generated by reacting 2，5-dimercapto-1，3，4-thiadiazole with nanoscale metallic silver［J］.RSC Advances，2014，4（65）：34294-34302.

［15］ ZHONG L B，YIN J，ZHENG Y M，et al.Self-assembly of Au nanoparticles on PMMA template as flexible，transparent，and highly active SERS substrates［J］.Analytical Chemistry，2014，86（13）：6262-6267.

［16］ HUANG J，MA D Y，CHEN F，et al.Green in situ synthesis of clean 3D chestnutlike Ag/WO3-xnanostructures for highly efficient，recyclable and sensitive SERS sensing［J］.ACS Applied Material&Interfaces，2017，9（8）：7436-7446.

［17］ ZENG Y，WANG L H，ZENG L W，et al.A label-free SERS probe for highly sensitive detection of Hg2+based on functionalized Au@Ag nanoparticles［J］.Talanta，2017，162：374-379.

［18］ 杜勇，方炎.卤离子吸附竞争对罗丹明B-金胶体系NIR-SERS的影响［J］. 光电子激光，2003，14（8）：881-885.

［19］ 李春颖，赖克强，张源园，等.表面增强拉曼光谱检测鱼肉中禁用和限用药物研究［J］.化学学报，2013，71（2）：221-226.

［20］ 张志刚，冰施，陈鹭平，等.液相色谱法同时测定水产品中MG和结晶紫残留［J］.分析化学，2006，34（5）：663-667.

［21］ 朱程云，魏杰，董雪芳，等.改进的QuEChERS方法用于鱼肉中MG、隐色MG、结晶紫和隐色结晶紫的快速检测［J］. 色谱，2014，32（4）：419-425.