反应时间对DPPH・法、ABTS＋・法评价抗氧化性结果的影响

林恋竹，赵谋明

目的：大多数抗氧化活性评价方法主要基于两种机制：氢质子转移（HAT）和电子转移（ET）。由于DPPH・法、ABTS＋・法操作简单，常被用作为抗氧化活性评价方法。用这两种方法进行抗氧化活性评价时，通常用固定反应时间下算得的 IC50值（自由基清除率为50%时所需试样浓度）表征抗氧化剂的抗氧化活性强弱。DPPH・法、ABTS＋・法并非纯粹基于ET机制，在反应过程中，也会伴随HAT机制。因此，在不了解抗氧化剂与DPPH自由基、ABTS＋反应的动力学机制的情况下，就简单将反应控制在某一时间下，并在相同条件下，与其它抗氧化剂的IC50值比较，可能对抗氧化剂的抗氧化活性带来错误的判断。本文研究了食品工业中常用的12种抗氧化剂与DPPH自由基、ABTS＋的反应动力学，为DPPH・法、ABTS＋・法评价抗氧化剂的抗氧化活性提供可参考的信息。方法：以食品工业常用的6种合成抗氧化剂（BHA，BHT，TBHQ，抗坏血酸棕榈酸酯，D-异抗坏血酸钠，和抗坏血酸）以及6种天然抗氧化剂（VE油，茶多酚，竹叶提取物，迷迭香提取物，单宁酸，和芦丁）为研究对象，采用紫外-可见分光光度法，分别研究这12种抗氧化剂与DPPH自由基、ABTS＋的反应动力学。根据 12种抗氧化剂对 DPPH自由基的清除率计算得到的 IC50值，将抗氧化剂分为两组：（1）单宁酸、茶多酚、TBHQ、BHA、抗坏血酸、芦丁、BHT、D-异抗坏血酸钠；（2）抗坏血酸棕榈酸酯、迷迭香提取物、竹叶提取物、VE油。前一组抗氧化剂配制成10 μg/mL；后一组抗氧化剂配制成30 μg/mL。分别测定不同反应时间下，测定反应体系在517 nm处的吸光度值，计算抗氧化剂对DPPH自由基的清除率，绘制抗氧化剂与DPPH自由基的反应动力学曲线；根据12种抗氧化剂对ABTS＋的清除率计算得到的 IC50值，将抗氧化剂分为两组：一组为：单宁酸、茶多酚、TBHQ、BHA、抗坏血酸、芦丁、BHT、D-异抗坏血酸钠；另一组为抗坏血酸棕榈酸酯，迷迭香提取物，竹叶提取物，VE油。前一组试样配制成100 μg/mL；后一组试样配制成600 μg/mL。分别测定不同反应时间下，测定反应体系在734 nm处的吸光度值，计算抗氧化剂对ABTS＋的清除率，绘制抗氧化剂与ABTS＋的反应动力学曲线。结果：TBHQ、抗坏血酸、D-异抗坏血酸钠、抗坏血酸棕榈酸酯、VE油与DPPH自由基反应时，反应速率很快，反应很快达到平衡。而单宁酸、茶多酚、BHA、芦丁、BHT、迷迭香提取物与竹叶提取物的与DPPH自由基反应时，其对DPPH自由基清除率随着反应时间延长显著增加。在反应初期（6 min时），各试样DPPH自由基清除能力按如下强弱顺序排列：单宁酸＞茶多酚＞TBHQ＞BHA＞抗坏血酸＞芦丁＞D-异抗坏血酸钠＞BHT；而在反应时间为18 min时，各试样DPPH・清除能力的强弱顺序发生改变：单宁酸＞茶多酚＞TBHQ＝BHA＞芦丁＞抗坏血酸＞BHT＞D-异抗坏血酸钠；在反应时间为42 min时，BHT的DPPH自由基清除能力超过抗坏血酸的DPPH自由基清除能力。BHA、抗坏血酸、TBHQ、D-异抗坏血酸钠、VE油的 ABTS＋清除能力随时间延长无显著性变化，其与ABTS＋的反应速率很快，反应很快达到平衡。而单宁酸、茶多酚、芦丁、BHT、竹叶提取物、迷迭香提取物、抗坏血酸棕榈酸酯的 ABTS＋清除能力随时间延长显著增加。在反应初期（6 min时），各试样 ABTS＋清除能力按如下强弱顺序排列：单宁酸＞茶多酚＞芦丁＞BHA＞抗坏血酸＝TBHQ＝BHT＞D-异抗坏血酸钠；而在反应时间为12 min时，BHT的ABTS＋清除能力超过了BHA、抗坏血酸、TBHQ。另外，在反应初期（6 min时），各试样ABTS＋清除能力按如下强弱顺序排列：抗坏血酸棕榈酸酯＞竹叶提取物＞迷迭香提取物＞VE油；而当反应时间为24 min时，竹叶提取物的 ABTS＋清除能力超过抗坏血酸棕榈酸酯。结论：不同抗氧化剂因其结构的差异，与DPPH自由基、ABTS＋反应速率不同，反应到达平衡的时间不同，若反应时间短暂，可能对抗氧化剂的抗氧化性评价带来错误的判断。采用DPPH法、ABTS＋法评定试样抗氧化活性时，当反应时间延长到60 min时，试样的DPPH自由基、ABTS＋清除能力排序已经趋于稳定。因此，可选用反应时间60 min作为DPPH法、ABTS＋法评价试样抗氧化活性强弱的最佳反应时间。

来源出版物：食品科学, 2010, 31(5): 63-67

入选年份：2015