OPN与VEGF在子宫腺肌病中的表达及意义

崔艳萍+薛洁好+刘群英

【摘要】 目的：检测骨桥蛋白（osteopontin，OPN）及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在子宫腺肌病病灶、子宫腺肌病在位内膜、正常子宫肌层及正常子宫内膜中的表达，从而探讨OPN、VEGF在子宫腺肌病发生与发展中的作用及两者的相关性。方法：采用免疫组织化学方法（S-P法）检测50例子宫腺肌病患者子宫腺肌病病灶、在位内膜及50例子宫肌瘤患者正常子宫肌层及正常子宫内膜中的OPN与VEGF的PU值。比较两组间OPN与VEGF表达水平差异。结果：OPN、VEGF在腺肌病在位内膜分泌期中的PU值高于增生期（P<0.05）；OPN、VEGF在腺肌病在位内膜增生期与分泌期的PU值均高于在正常内膜增生期与分泌期的PU值（P<0.05）。OPN、VEGF在子宫腺肌病中的表达经Pearson积差相关分析，无相关关系（r=0.014，P=0.920）。结论：OPN与VEGF在子宫腺肌病异位内膜及在位内膜中的过度表达，两者可能参与了子宫腺肌病的发生与发展过程。OPN与VEGF两者在子宫腺肌病中的表达无相关性，表明两者在子宫腺肌病的发生与发展过程中可能各自独立起到调控作用。

【关键词】 子宫腺肌病； 骨桥蛋白； 血管内皮生长因子

【Abstract】 Objective：To detect the expression of osteopontin（OPN） and vascular endothelial growth factor（VEGF） in adenomyosis focus，eutopic endometrium of adenomyosis，normal myometrium and normal endometrium to discuss the effect of OPN and VEGF in the occurrence and development of adenomyosis and the correlation between OPN and VEGF.Method：Immunohistochemical method（S-P method） was used to detect PU value of OPN and VEGF in adenomyosis focus，eutopic endometrium of adenomyosis of 50 patients with adenomyosis，and normal myometrium and normal endometrium of 50 patients with uterine fibroid.The differences regarding OPN and VEGF expression levels between two groups were compared.Result：PU value of OPN and VEGF in the proliferative and secretory phase of eutopic endometrium of adenomyosis was higher than that in normal proliferative phase，and the difference was significant （P<0.05）.PU values of OPN and VEGF in the proliferative and secretory phase of eutopic endometrium of adenomyosis were higher than those in the normal endometrial proliferative and secretory phase，there was a significant difference between two groups（P<0.05）.The expression of OPN and VEGF in adenomyosis was analyzed by Pearsons product-moment correlation analysis.There was no correlation （r=0.014，P=0.920）.Conclusion：The overexpression of OPN and VEGF in ectopic endometrium and eutopic endometrium of adenomyosis may be involved in the occurrence and development of adenomyosis.There is no correlation between OPN and VEGF in the expression of adenomyosis，indicating that both could play an independent role in the occurrence and development of adenomyosis.

【Key words】 Adenomyosis； Osteopontin； Vascular endothelial growth factor

First-authors address：Qingyuan Maternity & Child Healthcare Hospital，Qingyuan 511500，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.02.002

子宮腺肌病（adenomyosis）是子宫内膜细胞向肌层良性浸润的雌激素依赖性疾病。子宫腺肌病虽为一种“良性疾病”，但表现出的“侵袭、转移、复发”却是恶性肿瘤所表现出的生物学行为，不容轻视，其发病率年轻化并且呈上升趋势。目前许多研究表明虽发现有多种因素导致子宫腺肌病发病，但是相关研究理论对其很难做出较为理想的解释。因此，目前临床上对于子宫腺肌病的真正致病机制尚且没有统一、明确的理论说明。本研究通过免疫组织化学方法（S-P法）检测骨桥蛋白（osteopontin，OPN）及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在子宫腺肌病的异位内膜、在位内膜及正常内膜中表达的PU值，探讨OPN与VEGF的相关性，揭示OPN与VEGF在子宫腺肌病疾病发生发展过程中的作用。现报道如下。endprint

1 资料与方法

1.1 一般资料 此次研究选择在本院住院择期行手术治疗的50例子宫腺肌病患者作为研究组，病例的纳入时间为2014年1月-2016年12月，另选取同时期内在本院进行手术治疗的50子宫肌瘤患者为对照组。参与本次研究的所有患者入院后均进行腹腔镜检查，且经病理学检查，检查后确诊。并且，本次研究的100例患者中均无糖尿病、高血压、肾病等慢性病史，均未接受免疫药物及甾体类激素等治疗。

1.2 方法

1.2.1 研究标本分组如下：

1.2.2 所有标本收集、石蜡切片制作及实验方法 所有标本子宫切除后“Y”字形切开子宫前壁或后壁子宫肌层至子宫腔。研究组标本：切取腺肌病病灶（大小1 cm×1 cm×1 cm）、位内膜（大小1 cm×1 cm×0.5 cm）；对照组标本：距离肌瘤边缘2 cm以外切取正常子宫肌层（大小1 cm×1 cm×1 cm）、子宫内膜（大小1 cm×1 cm×0.5 cm）。制成石蜡块后对每个制作标本连续切成三片，每个标本的切片厚度为4 μm。其中，第一张标本使用HE进行染色处理，通过染色确定病理诊断，子宫内膜组织切片，通过病理组织进行增生期诊断和分泌期诊断。另外两张均采用免疫组织化学方法进行检测，分别对样本组织的OPN、VEGF进行检测。完成上述操作后，将石蜡切片放在恒温箱内进行烤片，使组织标本与载玻片紧密贴合在一起，避免石蜡切片脱落。放入恒温箱后，设定恒温箱的温度，温度设定为70 ℃，放置0.5 h。

1.2.3 实验试剂 本次研究使用福州迈新公司生产销售的兔抗人OPN单克隆抗体（抗体效价1∶100）为主要试剂产品，产品编号为sd-148，本研究使用的兔抗人VEGF多克隆抗体（即用型抗体）是由福州迈新公司提供的（产品编号：RAB-0157）。DAB显色液试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2.4 技术路线 技术路线如下：

1.2.5 HE染色切片结果判断

1.2.5.1 子宫腺肌病病灶 对HE染色切片情况和内膜中腺体的表现情况进行观察，重点观察两者是否存在不同步的问题，从子宫肌层中可以看到岛状的子宫内膜腺体和子宫内膜间质分布，伴有暗红色的出血量，但难以准确鉴别子宫内膜腺体是分泌期或增生期，见图1。

1.2.5.2 正常子宫肌层 HE染色下，切片组织中可见平滑肌束和结缔组织，组织肌层出现浆膜下层、中间层和黏膜下层，其中，中间层的厚度相对大于其他浆膜和黏膜下层，而两个下层组织表现出纵行平滑肌束，血管断面颇为丰富，见图2。

1.2.5.3 子宫内膜增生期 HE染色下，两组患者的病理组织结构并不存在显著差异，间质组织的致密度较高，螺旋动脉呈现主弯曲增长的趋势，且在动脉上可以看到柱状的腺上皮细胞，内膜腺体的数量相对较多，生长形态为弯曲，见图3。

1.2.5.4 子宫内膜分泌期 HE染色下，切片组织的腺腔内有腺细胞分泌物，腺腔呈现出膨胀的状态，内膜的腺体呈现主不断增大、弯曲的状态。内膜基质细胞增大，间质组织有水肿性增大，螺旋小动脉增长，且呈现出弯曲状态，见图4。

1.2.6 实验结果判定 OPN阳性表达颜色为棕黄色，形态为颗粒状，定位在内膜细胞的细胞浆中，间质细胞膜上的表达水平相对较低，且平滑肌细胞中不存在明确阳性表达。在位内膜增生期、在位内膜分泌期、子宫腺肌病病灶以及上皮细胞膜中均有不同程度的表达水平（图5、6、7）。VEGF阳性表达颜色为黄色，形态为颗粒状，主要定位在内膜细胞的细胞浆中，与OPN的阳性表达相同，间质细胞膜上的表达水平相对较低。并且，在病灶、增生期、分泌期、正常增生及分泌期均有不同水平表达（图8、9、10）。

本次研究中涉及的图像均采用Leica QW550图像分析系统进行分析，采用阳性单位表达免疫组化结果，用来表达反应免疫组化的阳性表达水平。具体如下：选择进行免疫组织化学法测定的切片组织进行随机测试，测试共包括五个视场，每个视场需要测定的细胞为20个。将切片标本自身存在的影响因素取出，根据图像的灰度对其进行分级，共分为256个等级，所分的每一个等级代表一个阳性表达单位，阳性值与阳性反应程度呈现正比例的关系。由图像分析系统对背景平均灰度值和待测结构的灰度值进行测定，最大值设置为256，具体计算方法如下：阳性值=

1.3 统计学处理 本次研究涉及的所有数据均纳入Excel表格和SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，两两比较采用t检验，多组间比较采用F检验；变量相关性数据采用Pearson积差相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组基线资料比较 观察组50例患者，年龄35～70岁，平均（45.20±4.65）岁。对照组50例患者，年龄38～57岁，平均（46.54±5.23）岁。两组患者一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

2.2 子宫腺肌病病灶与正常子宫肌层中OPN、VEGF的表达水平分析 在子宫腺肌病病灶和正常子宫肌层中均有OPN表达，两者OPN表达阳性值对比，差异有统计学意义（P<0.05）。在子宫腺肌病病灶和正常子宫肌层中均有VEGF表达，两者阳性值对比，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.3 腺肌病病灶与在位内膜增生期、分泌期中OPN及VEGF的表达情况 OPN在腺肌病在位内膜增生期、分泌期表达阳性值比较，差异有统计学意义（P<0.05）。腺肌病病灶中OPN与在位内膜增生期表达的PU值比较，差异有统計学意义（P<0.05），但与在位内膜分泌期比较，差异有统计学意义（P<0.05）。VEGF在腺肌病在位内膜增生期与分泌期表达的PU值比较，差异无统计学意义（P>0.05）；而腺肌病病灶中VEGF的阳性表达与在位内膜增生期、分泌期的PU值相比，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。endprint

2.4 正常内膜与在位内膜增生期、分泌期的OPN及VEGF表达水平 正常内膜增生期OPN阳性表达的PU值明显低于腺肌病在位内膜增生期，差异有统计学意义（P<0.05），正常内膜分泌期OPN阳性表达的PU值与腺肌病在位内膜分泌期表达比较，差异有统计学意义（P<0.05）。相对于腺肌病在位内膜增生期表达，正常内膜增生期VEGF阳性表达的PU值更低，差异有统计学意义（P<0.05），VEGF在正常内膜分泌期的阳性表达与在位内膜分泌期相比，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.5 OPN与VEGF的相关性 经分析，OPN与VEGF在子宮腺肌病中的表达无明显相关性（r=0.014，P=0.920>0.05），见图11。

3 讨论

子宫腺肌病是妇科临床上的常见病，主要是在各种因素的作用和影响下，子宫内膜间质、子宫腺体出现侵入子宫肌层的情况，并呈现出弥漫性增长趋势。该病的首要症状主要表现为月经过多、渐进性痛经、不孕不育，少数患者可能有性交痛的现象。近年来，子宫腺肌病的发病率呈现逐年递增的发展趋势，且以中年女性、经产妇为主要患病人群，对广大女性的身体健康和心理健康均造成了不同程度的负面影响。在子宫腺肌病患者中，约有25%的患者可能无明显症状，诊断往往是在其他原因切除子宫后做病理检查才得到诊断，导致此疾病的确切发病率不易统计[1]。子宫腺肌病的发病原因尚不清楚，异位子宫内膜来源至今尚未阐明，有学者认为机械性损伤是造成子宫肌层薄弱及子宫内膜-子宫肌层连接带出现病理改变导致子宫内膜基底内陷内膜细胞向肌层浸润生长的原因之一；其二有可能是女性卵巢功能失调导致发病，女性的卵巢功能失调，体内的雌激素含量过多，可能会对子宫内膜向子宫肌壁的生长起到刺激性影响，在位内膜细胞则会表现出更强的粘附性、浸润性、侵袭性，同时刺激血管形成；免疫学说则认为，免疫细胞数量功能异常，引起分泌细胞因子发生变化，免疫功能失衡或免疫调节异常是导致异位在子宫肌层内的异位内膜细胞继续存活和异位种植的关键环节[2-3]。

OPN是一种分泌型磷酸化糖蛋白的组织细胞因子，参与细胞迁移粘附，介导细胞免疫应答，抑制细胞凋亡、促进细胞增殖、活跃新生血管形成而发挥其重要生物学功能[4]。VEGF是一种特异性最高的络氨酸激酶受体蛋白的多肽类细胞因子，借助细胞间的介导传递功能，加速内皮细胞的繁殖和生长速度，对血管内皮细胞的增殖功能起到了刺激性作用，可诱导新生血管形成而发挥重要生物学功能[5]。

在此次研究中，子宫腺肌病病灶中的OPN、VEGF表达水平均高于正常子宫肌层，而腺肌病在位内膜增生期中的OPN、VEGF PU值分别为（19.29±8.05）和（29.79±4.58），而在正常内膜增生期中PU值分别为（11.41±4.36）和（16.58±6.47）；同样OPN、VEGF在腺肌病在位内膜分泌期中的PU值[（25.82±6.48）和（27.86±4.31）]明显高于正常内膜分泌期中PU值[（13.06±3.28）和（13.76±3.09）]，两者比较差异均有统计学意义（P<0.05）。在位内膜中OPN的表达上调促使子宫内膜细胞侵入子宫肌层；机体自身存在一定的应激机制，VEGF的介导或分泌是通过局部组织合成适当缺氧诱导因子而进行的，局部组织中会形成大量的新生血管，这些新生血管会重新排布，保障侵入肌层的子宫内膜细胞具备充足营养，这也就导致子宫内膜上更容易出现种植、迁移和增值的现象，侵袭性更强，从某种程度上对子宫腺肌病的进展起到了促进作用[6-8]。此外，本次研究中还对宫腺肌病在位内膜增生期与分泌期中的OPN表达情况进行了系统化研究，从研究结果中可以看出，增殖期的OPN阳性表达的PU值要低于分泌期。这说明OPN阳性表达在分泌期若出现上调，则会对相关细胞因子产生激活性作用，可能导致孕激素分泌量过多[9-12]。子宫内膜增殖期向分泌期转变，在此过程中，子宫内膜细胞的特性会受到孕激素等因素的影响，受到影响后自然发生变化，迁移性和增值性也会明显增强，这就导致分泌期内膜细胞进入子宫肌层的可能性更大，患者的患病率也就更高[13-15]。此外，在腺肌病在位内膜增生期与分泌期的VEGF表达对比上，增值期的PU值为（29.79±4.58），而分泌期的PU值为（27.86±4.31），虽然两个时期的PU值存在一些差异，但差异无统计学意义（P>0.05）。通过对腺肌病病灶中VEGF的阳性表达与在位内膜增生期和分泌期中VEGF阳性表达的PU值进行分别对比，差异有统计学意义（P<0.05）。从该结果中可以看出，增生期或分泌期，在位内膜组织中VEGF均高于正常组织，出现此种结果的原因可能是在位内膜中VEGF的表达上调，而子宫腺肌病是在内膜间质中，有新生血管，且原有血管进行重新分布，这就导致子宫内膜细胞的迁移速度不断加快，为肌层浸润提供更多的可能性[16-20]。

在本组研究中，对OPN、VEGF与子宫腺肌病的相关性进行了研究，但两者在疾病的发生和进展过程中是否存在协同作用，或者两者是独立发挥作用的，本研究中并未提及。本组研究结果显示，虽然两者的生物学功能相似性较高，但两者之间并不存在明显的相关性，说明两者在疾病的进展过程中极有可能是独立存在并发挥作用的，这与文献[9-10]报道的研究结果存在异议，出现此种现象的原因可能是本次研究与以往报道中的原发病类型不同。因此，OPN与VEGF的相互作用及具体的机制仍需继续研究。

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（收稿日期：2017-08-03） （本文编辑：程旭然）endprint